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作者：白海，司志刚，王存邦，薛智文，吴涛，杨小亮作者单位：(兰州军区兰州总医院血液科，全军血液病中心，甘肃 兰州 730050)
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6 E4 X# \$ t9 R# p7 x9 b' {, K, j 【摘要】 目的： 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制. 方法： 从骨髓中分离培养MSCs，反复贴壁进行纯化；用尼龙棉柱法纯化异体外周血T淋巴细胞；观察MSCs对植物血凝素（PHA）刺激下T淋巴细胞增殖的影响，用ELISA方法检测IFNγ，IL4水平变化. 结果： MSCs对PHA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用，并呈剂量依赖性；同时MSCs亦可抑制T淋巴细胞的IFNγ分泌，但可促进IL4的分泌. 结论： MSCs对异体外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用，其作用可能与其影响T淋巴细胞分泌IFNγ和IL4有关.
! ]% i7 x) g2 t$ U F" Q5 K$ t* L! A4 b 【关键词】骨髓间充质干细胞；T淋巴细胞；免疫调节；干扰素γ；白细胞介素4
4 {( n" f% b, j 0引言
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骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中不同于造血干细胞的另一类成体干细胞，这类细胞易于采集、分离和体外扩增，除具有高度增殖及多向分化潜能、促进机体造血重建外，还具有抑制同种异体免疫反应、减轻移植排斥等免疫调节作用，但具体机制还不清楚. 为进一步探讨MSCs的免疫调节功能，我们研究了MSCs对T淋巴细胞增殖及其分泌IFNγ与IL4的影响.
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% z- R% s5 g0 ^0 U$ U) |- d1材料和方法. g4 o. b& r. C
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1.1骨髓MSCs的分离、培养与鉴定抽取肝素抗凝的健康供者骨髓20 mL（n=10），DMEM（Gibco）倍比稀释，Ficoll分离液（天津灏洋）2000 r/min,15 min条件下分离出单个核细胞，DMEM洗涤2次，完全培养基（100 g/L胎牛血清 DMEM）重悬细胞，以2109/L接种于25 cm2培养瓶内，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养，24 h首次换液，以后每2～3 d换液1次，细胞融合度达80%时消化传代培养，流式细胞仪分析检测传至3代MSCs的纯度.% \( \3 Z- ], w M- k
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1.2外周血T淋巴细胞的分离与纯度鉴定取新鲜肝素抗凝人外周血20 mL，Ficoll分离液（2000 r/min,15 min）分离出单个核细胞，尼龙棉柱法进一步分选T淋巴细胞，流式细胞仪分析尼龙棉柱分离前后T淋巴细胞的纯度.
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1.3MSCs对植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）作用下的T淋巴细胞增殖的影响取第3代培养的MSCs，经60Co照射30 Gy，调整细胞密度，按细胞数分为3组，A组1103个，B组1104个，C组1105个，每组设单独同等数量MSCs为空白对照，以单独T淋巴细胞培养为阳性对照. 以终体积100 μL／孔，加入96孔培养板内，MSCs完全贴壁后吸去上清或更换培养液，并除空白对照外各组加入T淋巴细胞1104/孔. 经PHA 5 μg（Sigma）作用68 h后加入20 μL／孔MTT（Sigma）继续孵育4 h，弃上清后二甲基亚砜固定，酶标仪490 nm处测定A值，增殖百分率=（实验组A值-对照组A值）/实验组A值.0 p9 K9 [( j& v! M: P; _3 e! t$ G
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1.4MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞IFNγ，IL4分泌的影响分别用1107/L，1108/L MSCs与1109/L的T淋巴细胞共培养，同时加入5 μg 的PHA. 应用IFNγ，IL4试剂盒（武汉博士德）检测各组培养上清中IFNγ和IL4浓度.; u6 l7 S0 d+ t' O8 X9 _5 H2 q
# `; Q, k2 A4 P2 B9 _# T统计学处理：应用SPSS软件进行统计分析，实验结果用x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnettt检验，P, |) W* x% C }8 R
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2结果
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5 W/ \! _7 L' p" }* E6 R$ h2.1MSCs与T淋巴细胞纯度鉴定原代MSCs形态均匀一致，呈长梭形，流式细胞仪结果显示：传至3代MSCs高表达CD29，CD44和CD13，而CD34，CD45，HLADR低或极低表达，纯度达90%以上；异体外周血单个核细胞经尼龙棉柱分离后CD3 细胞百分比达98%以上.3 E4 E, K; [7 k2 t7 o# {) g
4 v3 B$ Z& u3 k# d8 d, _7 _2.2MSCs抑制T淋巴细胞的增殖MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞增殖呈抑制效应，并呈剂量依赖性. 单纯RPMI1640培养基条件下，T淋巴细胞阳性对照组的增殖率为（77.05±1.94）%，A，B，C组依次为（44.94±5.84）%，（33.45±7.00）%，（17.64±4.59）%，与阳性对照组比较均有统计学差异（P+ F% c; r: ?% b
4 b. z$ `" ?+ _+ O2.3MSCs抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IFNγ为（79.16±13.40）ng/L，与1107/L，1108/L的MSCs共培养时IFNγ的分泌分别为（25.54±7.05），（9.55±3.60）ng/L，IFNγ分泌明显减少（P
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" S6 W4 g9 B& H3 _+ {2.4MSCs促进T淋巴细胞IL4的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IL4的量为（46.04±9.67）ng/L，加入1107/L，1108/L MSCs后，IL4的分泌增加，分别为（67.10±11.44），（97.92±19.48）ng/L，与单纯T淋巴细胞培养组比较差异具有统计学意义（P0 t. R: w( ~' {
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MSCs是骨髓中的一类成体干细胞，是造血微环境的主要细胞成分，能分泌多种细胞因子，在维持造血微环境的稳定中起重要作用［1］. 在特定条件下具有向脂肪细胞、成纤维细胞、成骨细胞等多系分化的能力［2］. 目前研究发现，骨髓MSCs还具有免疫负调节和降低移植物抗宿主疾病(graftversushost disease, GVHD)的作用［3-4］. 小鼠的移植实验及临床的I，II期研究均发现，骨髓MSCs与造血干细胞共输注可以降低异基因造血干细胞植入引起的GVHD. Bartholomew等［5］将体外扩增的供者MSCs输注给行皮肤移植的狒狒体内，结果是皮肤移植物被排斥时间明显延长,提示MSCs具有免疫负调节能力. 并且骨髓MSCs低表达或不表达MHC II(HLADR), B7, CD40和CD40L，说明MSCs可能不具免疫原性，自身不引起T细胞的识别而产生免疫排斥［3］，为进一步临床应用提供了可能.
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我们的实验结果亦表明MSCs能抑制PHA诱导的异体T淋巴细胞的增殖反应，并且其抑制作用与MSCs的细胞数量有关，呈细胞数量依赖性，与报道一致［3］. MSCs对T淋巴细胞增殖抑制作用的机制尚不清楚. 有学者指出，MSCs发挥免疫抑制效应无需抗原递呈细胞或CD4 CD25 调节性T细胞参与［6］，提示细胞间的直接接触是MSCs发挥抑制效应的重要环节；MSCs在体外培养条件下能分泌多种可溶性细胞因子，如TGFβ，HGF，可能是介导MSCs免疫调节作用的重要因子［7］，为了解MSCs对T淋巴细胞分泌细胞因子的影响，我们检测了MSCs作用下T细胞培养上清中IFNγ和IL4的变化，结果表明MSCs可抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌，而促进IL4的分泌，并且在本检测条件下，MSCs对这二类细胞因子的影响具有一定的MSCs细胞浓度依赖性. 已知IFNγ是Thl细胞免疫正调节因子，而IL4主要由Th2细胞分泌的细胞因子. 结果说明MSCs可能以抑制Thl, 增强Th2的功能为主. 在异基因造血干细胞移植后GVHD发生的病理生理过程中，除了直接由T细胞介导的细胞毒作用外，大量的炎性细胞因子如白细胞介素(IL)，肿瘤坏死因子(TNF)，干扰素(IFN)等参与了GVHD的发生发展. 特别是在急性GVHD中，IFNγ是关键调节因子，在促使单核巨噬细胞产生大量IL1和TNFα中起重要作用［8］，因此，T细胞分泌IFNγ的减低，可以消减GVHD发生发展中免疫应答和“细胞因子风暴”的恶性循环，降低GVHD发生. 有证据表明，IL12，IL4对Thl和Th2细胞的分化启动和进一步发展起着主要作用［9］. Th2细胞分化的最主要决定因素是IL4. 此外，IL4对Th2细胞的增殖、基因转录以及抗凋亡也起着十分重要的作用，从而可减低GVHD和移植物排斥的发生. 所以MSCs体外抑制T细胞增殖并减少T细胞IFNγ的分泌, 增加IL4的分泌,可能是MSCs体内预防和减轻GVHD的机制.
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