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作者：吉光荣，姚猛，陈立民，孙崇毅，王立春作者单位：哈尔滨医科大学附属第二医院脊柱外科，哈尔滨 150086
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% P) ~3 {( r) @1 k! j6 {1 g 【摘要】 ［目的］观察经携带人骨形态发生蛋白2（BMP2）基因的复制缺陷重组腺病毒（AdBMP2）转染的兔骨髓间质干细胞（MSCs）在以兔脱细胞脱钙骨基质作为组织工程承载体中的生长情况及转基因前后细胞成骨能力的变化。［方法］用携带有人BMP2基因片段的复制缺陷重组腺病毒（AdBMP2）转染兔骨髓间质干细胞并将其种植在兔脱细胞脱钙骨基质支架中，扫描电镜观察转基因细胞在支架中的黏附生长情况；并通过检测培养上清中的碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（BGP）含量及Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）的分泌量来评估转基因对MSCs成骨能力的影响。［结果］转基因骨髓间质干细胞在组织工程支架中黏附生长良好，转基因组细胞的ALP、BGP含量及Ⅰ型胶原的分泌量与对照组比较差异有显著性意义。［结论］转基因骨髓间质干细胞在兔脱细胞脱钙骨基质支架中能很好的黏附并立体生长，转基因细胞在目的基因所表达的BMP2蛋白作用下成骨能力明显增强。 1 k$ z& q" }0 [ g, A! \! {* E
【关键词】骨形态发生蛋白； 骨髓间质干细胞； 转基因； 组织工程9 r: m( @* Q% j" Y1 s0 {' P
在骨组织工程领域，由于骨修复重建过程中所要求的特殊生物力学性能、生物相容性、骨传导性、使骨组织工程支架材料的研究一直备受重视〔1、2〕，本研究旨在观察以转基因兔骨髓间质干细胞作为种子细胞，将转基因细胞与兔脱细胞脱钙骨基质支架材料复合后观察细胞在承载体中的生长及成骨转化的情况，为组织工程骨移植替代物的应用奠定实验基础。6 ]( w) w3 `9 B1 |% @
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% O& f) X6 K9 A 1材料与方法9 \' j1 K: ?. Y9 S' a; H4 ~* d
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1.1实验材料1 _6 O% \1 |) T: @0 v
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携带人BMP2基因片段的复制缺陷重组腺病毒载体（AdBMP2）由本实验室国内首先构建〔3、4〕。ECL Western Blotting System（Amersham Phamaeia）：碱性磷酸酶检测试剂盒（上海科华-东菱有限公司）；骨钙素检测试剂盒（北京北免东雅免疫技术研究所）：βGP（Merck）;鼠抗人BMP2单克隆抗体、鼠抗兔Collagen Ⅰ单克隆抗体。- {& M# K5 W' b3 z( ` Q
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6 O" d5 j# i/ b+ b 1.2实验方法4 ?, K, J! O1 _! t% V! q
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" r5 D' @* n+ p& f/ O 1.2.1实验动物及分组2 n0 A1 {8 s" Y) g& h0 q
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6～8周龄的日本大耳白兔20只，双侧取材，左侧肢体来源细胞定为转基因组，右侧为对照组。1 H' {; q9 ~* S6 G+ k6 o8 ^
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1.2.2脱细胞脱钙骨基质支架的制备
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: M0 _% Y& y& b# _6 A3 t4 S 选取新鲜兔股骨下端松质骨，切成2 mm3 mm7 mm形状规则的长方形骨条，并使取材各骨块的表面孔隙率基本相同，所截取骨块内不含软骨和皮质骨成分。用50 ℃水反复冲洗，沥干，氯仿：甲醇（1：1）脱脂12 h，0.25 mmol／L氢氧化钠脱脂48 h，30％过氧化氢脱蛋白48 h，丙酮处理2 h，0.6 mmol／L盐酸表面脱钙25 min，蒸馏水浸泡24 h,干燥，环氧乙烷熏蒸除菌，密封包装备用。
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1.2.3AdBMP2转染兔MSCs及转基因细胞与支架材料复合0 p7 W! I1 W+ k( M0 j% o/ b
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取3代生长良好的MSCs，参照文献〔5〕进行转染。转染后两组细胞胰酶消化制成单细胞悬液（5106／ml），均匀接种于24枚生物衍生骨块。4 h后缓慢加入培养液1.5 ml，常规培养1 d后，取4枚材料块，2.5％戊二醛固定，CO2临界点干燥，纵向剖开，喷金，扫描电镜观察细胞附着、生长情况。余下材料块于培养液中继续培养1周。& q) p, V2 K! A
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收集转染组及未转染组细胞支架复合物培养3 d后的培养上清液，行Western bloting检测人BMP2蛋白表达情况。
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1.2.5转基因细胞成骨能力的变化
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转染7 d后采用BGP放免试剂盒检测各组细胞上清中OCN含量、采用ALP检测试剂盒定量检测ALP含量、Western blotting法分析AdBMP2转基因对MSCs细胞Collagen Ⅰ在蛋白表达水平的影响。
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) M5 v& H9 O# d" J 上述测量数据以x-±s表示，采用SPSS（v 11.5）统计软件进行检验。
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2.1转基因细胞在脱细胞脱钙骨基质支架中的黏附生长
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培养1 d后，扫描电镜见支架材料表面平整，规则分布一些陷窝和孔隙，孔隙直径大约200～300 μm，转染人BMP2基因的MSCs在生物衍生骨支架中均匀分布，呈现立体生长态势，转基因细胞黏附伸展良好，呈细长梭形，有较长突起（图1）。高倍镜下见细胞伸出丝状突起，相互网络（图2）。
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. v/ f* N- ~: r0 ] 2.2转基因细胞人BMP2蛋白表达
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种植细胞于生物衍生骨支架3 d后，各组培养液上清行Western blotting检测结果显示转基因组细胞可有效地分泌人BMP2蛋白，而对照组呈阴性（图3）。# r5 o; U3 n4 E) W0 `; {
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$ a( t7 t6 t. E$ M- f5 S4 f 3转基因对MSCs成骨能力的影响
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% P/ F, O- v2 X1 {: X 3.1碱性磷酸酶（ALP）测定结果' o" c, T7 C" J6 K
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转基因7 d后取各组细胞培养上清经ALP检测试剂盒分析结果显示：转基因组ALP分泌量为（8.11±0.53）U/L，对照组为（4.36±0.61）U/L，两者相比差异有显著性意义（P＜0.01）。8 L$ Q- m/ k& w" g4 I. ~; u
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3.2各组细胞骨钙素表达检测结果
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各组细胞培养上清经BGP放免检测试剂盒分析结果显示：转基因MSCs组OCN分泌量为（25.71±0.89）ng／ml,对照组MSCs的OCN分泌量为（13.79±1.27）ng／ml，两者差异有显著性意义（P＜0.01）。3 x& j( _: o/ ^3 z' ?" P
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5 N/ y6 [0 L, A8 i/ }, Y 3.3各组细胞外基质的检测结果
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各组细胞行Western blotting检测结果显示：转基因组细胞Collagen Ⅰ呈强阳性表达，对照组仅呈弱阳性（图4）。. o, c6 Z1 ~$ T" o8 q6 L" O+ v; s3 b% J
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图1MSCs在生物衍生骨支架中均匀分布，呈现立体生长态势，转基因细胞黏附伸展良好，呈细长梭形，有较长突起（略）; C5 q/ b4 [1 }' z& X' {" k& k
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& w r: N7 O/ Z, p6 a9 t0 f8 H. o2 w 图2高倍镜下见细胞伸出丝状突起，相互网络（略）
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图3BMP-2 Western blotting结果（略）
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& P0 X" a/ @& o, [8 j 1：rhBMP-2;2：MSCs;3：Ad-BMP-2 infected MSCs: s% `; P \+ A- L; S9 X
i$ |7 p& v3 [' ~8 [1 S 图4Collagen Ⅰ Western blotting结果（略）
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1：标准Collagen Ⅰ;2:转基因组MSCs;3:对照组MSCs0 O' J3 @% q# O" w P9 e8 w
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应用组织工程骨修复骨缺损现已成为国内外学者广泛认同的发展方向，其中种子细胞的选择是组织工程化骨的前提与关键〔6〕。近年来，骨髓间充质干细胞（MSCs）因其取材方便、损伤小及成骨能力较确切，正日益受到重视。MSCs作为多能干细胞有多种分化的潜能，但其分化并非是一个完全自发的过程，某些细胞因子及体内环境对其分化有一定的促进作用〔7〕。研究表明〔8〕，作为种子细胞单独应用时,MSCs骨化过程较慢，体内细胞移植后早期细胞外基质形成不足时，植入的MSCs就会失去依托和紧密的细胞间黏附，局部的成骨微环境形成将受到阻碍，不能及早确立优势成骨细胞群而阻碍成骨。且有学者〔9〕比较不同来源成骨细胞的生物学活性后认为MSCs增殖活性强，成骨活性弱，认为需经改造才能成为理想的种子细胞。因此如何提高MSCs的成骨潜能，使其多量稳定地向成骨细胞转化，将是优化骨组织工程种子细胞的关键环节。0 S. B, w: g! s }
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2 f) D8 N+ r- _ 笔者采用人BMP2基因转导是因为BMP2蛋白具有高度的同源性、种属差异极小，以便为今后的临床应用打下实验基础；采用复制缺陷重组腺病毒作为载体是因为腺病毒载体转染效率高，且该病毒是去除了更多病毒结构基因的病毒载体，仅表达极少量的病毒结构蛋白，因而可以大大降低免疫源性。通过实验证实MSCs对AdBMP2有较好的易感性。因而利用转基因技术可以将外源BMP2基因导入靶细胞内并使之持续、稳定、高效表达所需BMP2蛋白，进而弥补BMP2局部应用的缺陷，大大提高局部BMP的浓度，形成优势成骨细胞群，并及时产生特定的成骨微环境而利于骨修复。8 \0 x, h. k, \
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: ?: ]1 j4 G6 L* h3 G. u4 W- N 理想的载体材料应具备与种子细胞的良好相容性、形状的可塑性、易降解性和低抗原性等优点〔10〕。且将转基因细胞种植于组织工程支架中，关键在于材料表面微环境应利于细胞黏附、增殖，更重要的是材料能激活细胞特异基因表达，维持细胞正常表型，其中细胞与材料的黏附是细胞增殖和分化的基础〔11〕。本实验扫描电镜观察到转基因细胞在脱细胞脱钙骨基质支架表面贴附伸展良好，脱细胞脱钙骨基质天然的孔隙结构便于细胞生长增殖。转基因细胞通过自分泌和旁分泌作用表达BMP2蛋白使MSCs向成骨细胞转化已近成熟期，细胞ALP活性增高，在矿化诱导液作用下其分泌的胶原纤维能够亲和钙盐，进而加速了局部矿化；转基因组MSCs的细胞外基质合成活跃，Ⅰ型胶原和钙基质分泌较对照组有明显提高，为MSCs的生长提供自源性支架；而ALP的酶学作用及细胞外基质成分的积聚为其提供适宜的钙磷浓度和酸碱度，有利于诱导成骨微环境的形成，从而显著提高MSCs的成骨潜能。成骨细胞的特征性表型有高碱性磷酸酶表达、合成Ⅰ型胶原及分泌骨钙素〔9〕，这已成为国内外学者一致公认的检测标准。笔者以AdBMP2转染MSCs后证实转基因组细胞的ALP于BGP分泌量明显高于对照组，且具有统计学意义，从而证实了转基因对MSCs的成骨能力有较大的提高。% g) f, y$ N7 [. H+ T6 f7 B/ Z
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发表于 2009-3-3 12:35
发表于 2010-1-19 15:19
