细胞培养基本技术

liqinzhan

一、清洗
: d4 M7 y" R, q: H% I6 h9 d* N/ S* |" e, h
新采用和重新使用的培养器皿，都要严格清洗，以防各种有害物质对培养细胞损害。培养用的塑料器皿目前主要依靠进口，均已无菌密封包装，可直接使用。对于塑料瓶盖或胶塞等，可水中浸泡后用2％NaOH煮沸10～20min，自来水中浸泡和蒸馏水漂洗2～3次，晾干备用。细胞培养中的绝大部分器皿系玻璃制品，清洗过程为以下步骤。
- M; V( ?; ^( n: o1 Z) W1 u( S, e9 L* ]2 r6 p
1. 浸泡　新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。
4 I4 c# J3 |9 [1 P- N  H! ^1 l( e, P' R. Y/ @! D) n3 ?: w. N
2． 刷洗　浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。
! g1 Q) y  N2 g, X6 v' T; x! x- Q, A: Z$ F
3． 酸浸　刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。  _7 v/ _" s' X: Q7 F, \. A
9 m5 g: c# K- m) g" X# F
4． 冲洗　浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，烘干备用。要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
+ f' s& e/ F- A' S3 @) w$ F  {/ _1 Z9 Q+ K
二、消毒
9 k; W9 b! I& V8 _# F, N2 K
2 q# h: }- A" [2 o  d. b' n1. 包装　器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。9 |4 Z0 B8 J+ U6 e9 u

  Y" L; x. L' U3 a2. 消毒　消毒灭菌随物品的不同，而采用不同的方法。
  g( ]% k7 \: L, V% B$ c+ k
5 m& W9 ^4 {0 `- G( U4 R, m（1）紫外线：主要用于消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。
+ c7 Y* D! h3 x3 @( I# \. u& B0 z
6 D* H. f# e, ^7 `% y（2）消毒剂：操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用碘酒、酒精消毒。无菌室内桌椅和物体的消毒可用0.1％新洁尔灭、过氧乙酸、来苏儿等擦拭或浸泡。实验室、无菌室的消毒可用甲醛熏蒸（高锰酸钾5～7.5g，加40%甲醛10～15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，房间密闭24h即可）。0 G5 v3 v/ G4 M9 L. Y  l5 O
' d1 E3 y  B# Q# \) ^# e7 S& t
（3）干热消毒：多用于玻璃器皿消毒，干热烤箱180℃45～60min。
2 F* E. ?# |6 w$ B, a% x9 y& t' [5 x- A% T5 ^
（4）湿热消毒：培养液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa（115℃）高压灭菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa（121.3℃）高压灭菌15～20min。
' X" N/ N- w" T! ]8 v% M. {* x$ t8 `. |" \0 C  b
（5）滤过消毒：用孔径200～450nm大小的滤板可除去培养液和试剂中的细菌和霉菌等。用200nm孔径的滤板通过两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。滤器分为负压和加压式两种。过滤的液体量很少时，可选用注射器微量滤膜滤器。) j4 {& ?0 C. B, D' s$ x- p. @1 c
1 y5 f1 H# Z9 i' E, T" z9 l8 X
（6）60Co照射：不耐热的塑料制品或一次性用品的灭菌可经包装后，用γ射线照射消毒。
) P8 Z1 L7 b6 c, C
  I( Z; W- K8 N/ c* ^5 O' s: S" R三、无菌操作
2 k, F6 i5 I- z# m* j: @! q/ l# J, D+ p9 D% D/ p- v0 D* _
无菌操作是防止污染、决定培养是否成功的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。工作前对手部需清洗消毒，进无菌操作室时戴口罩和穿工作服。不能用手直接触及已消毒器皿内部。打开培养瓶前或封闭瓶口前须火焰烧灼瓶口等。: n7 O" w8 n* b' G. |

1 t  J. `8 g; G/ V* H  c. N+ {四、取材0 D6 p% U" l$ \8 e2 q
, y5 V! Z% t# N% B, G% Z
取材应注意无菌操作，防止污染。污染组织应放入含两性霉素B（2μg/ml）、青霉素（500u/ml）、链霉素（500μg/ml）的培养液中浸泡10～20min。取材后应立即进行培养。如因故不能培养时，应在无菌条件下，把组织块切成1cm3大小置于培养液中37℃贮存。存放时间不宜超过24h。
( R  o& s, i; a* p- T( O
3 q& D) J, `$ n7 ]1 z% D2 k5 x1 z1． 源自人体的肿瘤和其他病理组织的取材、贮存和运送须注意防止污染。
0 P3 j4 M4 x' W" o! T' ?7 ~2 I# ]
! r. N, T" }! L9 l$ h; p2． 取血：多采用静脉血，注意无菌操作，如需应用肝素等抗凝剂，也要注意消毒处理。血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液，可采用离心法分离，500～1000r／min，离心5～10min即可。# a$ q4 K5 S" f) e8 @# f% j
8 d3 j" T2 S! }% K
3． 动物组织：动物皮毛易隐藏微生物，且不易消毒，应特别注意无菌操作。. \, @+ M( F/ M8 a/ s8 P5 N0 F, |
. Q4 H# p7 M% O; n' f/ B0 C
五、细胞分散法$ t. O# W4 o% D; S4 v. l, \
/ x9 K+ N5 o1 T: c
1． 机械分散　对于脑、胚胎、肿瘤等软组织，先用组织匀浆器研磨组织，再通过细胞筛获得单细胞悬液。) L6 F# f0 x; a. I0 ?) A
0 m1 P- S$ z& v) Z, F* z% e" @
2． 胰蛋白酶消化　适合于消化间质较少的软组织，传代细胞消化也常采用，是应用较广泛的消化酶，由于Ca2+ 和Mg2+ 对胰蛋白酶活性有一定抑制作用，因此须用不含这些离子的缓冲液配制。将组织剪成1mm3大小，置于容器中，加入30～50倍体积的0.25%胰蛋白酶液，消化30～60min。0 G* B+ a, J' R8 G7 u. @" \
! e, n" u2 B) Z( Z: V
3． 胶原酶消化　对胶原有较强的消化作用，适用消化纤维组织、上皮组织及瘤组织等。胶原酶的使用终浓度为200U/ml或0.1～0.3μg/ml，其消化作用缓和。一般将3～5倍胶原酶溶液加入已剪碎的组织块中，数小时或10余小时后，可见组织块逐步变小至几乎看不见，原来澄清的消化液转变成混悬液时，可以终止消化，如组织块较大、细胞量较多时，可于消化期间换消化液一次。消化液经低速离心5min后，去上清液，加入20％小牛血清培养液，轻轻打散细胞团，制成细胞悬液。: o* i" Z5 J2 t' e9 a$ G& h) r

1 D  {. e4 I8 `7 e: |0 {4． EDTA溶液分散　使用浓度为0.02%的EDTA溶液。常用于传代细胞的消化，作用温和，毒性小。+ U1 F% T/ A6 r& v

- X$ b0 o( Z1 E% o2 M六、淋巴细胞分离法& w4 ~  c3 I" |# O* K  c5 g

! h% u# x  F' E- c8 q- p: z  n取肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀释后，沿试管壁慢慢加入4ml淋巴细胞分离液之表面，勿与分离液混合。然后2000r/min水平离心20min，管内分4层，自上而下依次为血浆、单个核细胞(位于细胞分离液上界与血浆下界的中间呈白色雾状层)、颗粒白细胞(位于淋巴细胞分离液下界与底层红细胞上界的交界处)和红细胞(位于管底)。用毛细吸管沿管壁轻轻吸出的淋巴细胞层。然后用Hanks液洗两次，每次2000r/min离心10min，最后计数供用。
  A4 ?0 N; w3 O& `
+ p9 }  w1 o. e  c七、细胞计数
! D4 [$ T% E+ n2 s' S; ~) }9 g+ b) U* N/ z' l6 R- D
待测细胞悬液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%台盼蓝0.1ml(死细胞着色),混合后滴入血球计数板内。于低倍镜下计数4角的4个大方格内的活细胞(透明未着色)总数,然后用下式计数:
- A4 t$ g6 [" f* y* `& A# Y. y5 D! b7 S
细胞数/每毫升原液=(4大方格内活细胞数/4)×104×稀释倍数3 V8 V- [5 @) [4 P. W) H
* ^! H8 o% r4 @4 g5 I
细胞存活率=(活细胞数/活细胞数+死细胞数)×100％* \7 G' y6 ~. O

# A: C& v7 M+ ]在计数时遇到对大方格压线的细胞，应按数上不数下,数左不数右的原则进行计数。

2006goodluck

和泽村

谢谢分享