碱性成纤维细胞生长因子预诱导对骨髓基质干细胞向多巴胺能神经元分化的影响 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:35 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：陈欢意，牛平，赵帅，杜迎春作者单位：110016 沈阳军区总医院神经内科 7 ?  p. }* S8 c+ E" A
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      【摘要】  目的  探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导对骨髓基质干细胞（MSCs）向多巴胺（DA）能神经元分化的影响。方法  取雄性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓，进行MSCs的体外培养、传代扩增及纯化。bFGF预诱导24 h后，依据加入的神经营养因子不同分为单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1）组、胶质源性神经营养因子（GDNF）组和GDNF GM1组,以及对照组。倒置显微镜下观察细胞形态变化，分别在预诱导第3 d、7 d进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）、酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数，并计算阳性细胞百分比。结果  对照组见少量NSE阳性细胞。实验组于诱导第3 d、7 d见较多数量的NSE、TH阳性细胞，GFAP阴性。bFGF预诱导各组中GDNF GM1组NSE、TH阳性细胞率最高，GDNF组次之，GM1组最低，组间比较差异有统计学意义(均P
      【关键词】碱性成纤维细胞生长因子；骨髓基质干细胞；多巴胺能神经元* M9 }) v0 o  j2 X, i. z: F& ~
   　　Effects of basic fibroblast growth factor preinducing on marrow stroma cells which were induced into dopaminergic neurons in vitro
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　　CHEN Huanyi, NIU Ping, ZHAO Shuai, et al.# _" X" v% s9 r
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　　Department of Neurology, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, China; r+ Z7 k% `6 Z/ W
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　　Abstract：ObjectiveTo explore the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) preinducing on marrow stroma cells (MSCs) which were induced into dopaminergic neurons.MethodsThe rat MSCs were isolated primarily from the femurs and tibias of the Wistar rats. MSCs were cultured, proliferated and purified by passage culture. After being induced by bFGF, cultuered MSCs were divided into experimental groups (GM1 group, GDNF group and GDNF  GM1 group) and control group. The surface markers of the differentiated neuron, such as neurone specific enolase (NSE), glial fibrillary acidic protein (GFAP) and TH were detected by immunocytochemistry after MSCs were cultured in induction media for 3 days and 7 days.ResultsIn control group, the NSE expression of MSCs was very low. Many NSEpositive cells and THpositive cells were found in the experimental groups at 3 or 7 days after induction. The percentage of NSEpositive and THpositive cells of GDNF GM1 group was significantly more than the other experimental groups (all P
1 W# f, f+ Q" @

　　Key words：basic fibroblast growth factor;bone marrow stromal cells;dopaminergic neuron

　　近年来，细胞移植在帕金森病（PD）治疗方面的研究日益增多［1，2］。骨髓基质干细胞（MSCs）在特定条件下可以完全分化为多种间充质细胞，具有自我更新能力及多向分化潜能，用于细胞移植及基因治疗有许多优势。目前虽然已能够在体外使MSCs转化为神经元样细胞，但诱导转化率较低，故提高诱导转化率，并使MSCs特异转化为具有正常功能的神经元是其在临床应用之前须待解决的关键问题。本实验采用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导后，再联合两种细胞因子体外诱导MSCs向多巴胺（DA）能神经元转化，目的是寻求体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件，为PD的细胞及基因治疗奠定实验基础。

　　1材料与方法
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　　1.1材料. p  N. T3 O4 G  e$ T) N0 M- l

　　1.1.1实验动物雄性Wistar大鼠30只，4～6周龄，质量100～150 g。
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　　1.1.2试剂及仪器医用净化工作台（VS1300LU型）；CO2培养箱（Galaxy200，英国）；LDMEM培养基（美国Hyclone公司）；标准胎牛血清（天津灏洋生物工程公司）；淋巴细胞分离液（上海恒信化学有限公司）；胰蛋白酶（上海生工生物公司）；鼠抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体、鼠抗神经胶质酸性蛋白（GFAP）单克隆抗体、山羊抗鼠HistostainSP试剂盒(北京中山生物工程有限公司)；鼠抗酪氨酸羟化酶（TH）单克隆抗体（上海长岛生物公司）；重组人GDNF（美国Pepro Tech EC公司）；重组鼠bFGF（澳大利亚TBD Science公司）；神经节苷酯（GM1）（TRB Pharma S.A药厂）。) ?6 d, A2 W) |8 Y0 E3 N$ x
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　　1.2方法: ^. C! S7 Q4 Q7 u6 u3 ^9 r" l
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　　1.2.1MSCs的分离大鼠用窒息法处死，浸泡于75％乙醇中消毒5 min。无菌条件下剥离下肢皮肤和肌肉，充分暴露胫骨和股骨，离体剪断两端，放置于无菌培养皿中，75％乙醇浸泡5 min；采用同样方法取另一侧下肢骨。生理盐水洗涤3遍后，浸泡于LDMEM培养液中。净化工作台上，分别剪开股骨和胫骨两端，暴露骨髓腔，用5 ml注射器吸取LDMEM培养液，多方向、多角度反复充分冲洗骨髓腔，所得骨髓液依次经7号和4号针头吹打，制成单细胞悬液，收集、混匀。采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞［7］。将骨髓液以1∶1等体积缓慢加入淋巴细胞分离液上层，2500 r/min离心25 min，小心吸取中间黄色单个核细胞层。加入DMEM 10 ml，1000 r/min离心5 min，洗涤，反复两次，弃上清。

　　1.2.2MSCs的培养和传代扩增取60 mm培养皿，血球计数板计数后，以1105/ml的密度接种骨髓液于含10％胎牛血清的LDMEM培养液中。置于37℃ 5%CO2饱和湿度的CO2孵箱中培养，接种后第3 d首次换液去除悬浮细胞，以后每3 d换液1次，同时于倒置显微镜下观察记录细胞的形态变化。待贴壁细胞生长融合达80％以上时，以0.25%胰蛋白酶（0.1 ml/cm2）消化 2～3 min后，加入含血清的培养基终止消化。反复吹打皿底细胞，镜下观察细胞成单细胞悬浮状，1000 r/min离心5 min，去上清，加入培养基，重悬。按1传2的比例进行传代培养，直至贴壁细胞彼此融合铺满皿底时，重复上述操作。+ E* @' O2 U7 i5 B! W* O2 x* G: P7 d

　　1.2.3MSCs的纯化采用贴壁培养法，每次换液弃除悬浮生长的造血细胞。贴壁细胞主要是MSCs，但可能混有淋巴细胞、单核细胞，每次传代用0.25％胰蛋白酶（0.1 ml/cm2）消化2～3 min，严格控制胰酶的量和消化时间，利用MSCs较易脱落的特点，保证MSCs在短暂的作用时间内与培养皿底分开，淋巴细胞、单核细胞则因贴壁性强仍贴附于培养皿底，从而使MSCs得到纯化。5 w, U% G# \% `2 _  k- H* m( i- i

　　1.2.4体外诱导MSCs向神经元分化将Passage 3～5代骨髓MSCs悬液接种在铺有盖玻片的直径60 mm塑料培养皿中，待细胞生长达80％～90％融合时，开始进行诱导分化。在LDMEM培养基中加入bFGF（20 ng/ml）进行预诱导24 h后，再依据加入的神经营养因子不同分为3组：(1)GM1组：LDMEM培养基中加入GM1（100 ng/ml）；（2）GDNF组：LDMEM培养基中加入GDNF（20 ng/ml）；（3）GM1 GDNF组（G G组）：LDMEM培养基中加入GDNF（20 ng/ml）、GM1（100 ng/ml）。整个诱导过程中，于倒置显微镜下密切观察细胞形态变化，并在诱导第3 d、7 d时进行免疫细胞化学检测。对照组不加入bFGF预诱导，也不加入神经营养因子。
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　　1.2.5免疫细胞化学检测对照组及实验组于诱导第3 d、7 d时进行免疫细胞化学染色（SP法），分别观察各组不同时点预诱导与未预诱导NSE、GFAP、TH阳性细胞率。阴性对照以PBS代替各单抗。% l' x" c6 T! Y) N2 Y

　　1.2.6数据收集倒置显微镜下随机选择10个非重复视野（100），分别计数NSE和TH阳性细胞数，计算阳性细胞百分比。% K* I% m: w) b( B, i- `% X

　　1.2.7统计学方法数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，用SPSS 10.0软件包分析。
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　　2结果- c' X& Q+ y- _+ v( m  N

　　2.1MSCs的培养、传代及扩增接种6 h后，骨髓液中体积较大的单个核细胞开始贴壁，贴壁初，细胞形态无变化。24 h后贴壁细胞开始变形，长出细小突起。贴壁细胞形态有长梭形、巨大扁平形、球形细胞3种。细胞增殖速度较快，5～6 d出现多个细胞组成的细胞克隆，10～14 d细胞融合成单层，排列有一定的方向性。细胞密集生长处呈漩涡状、菊花状。待细胞增殖到80％～90％融合时进行传代。细胞纯度达到90％～95％后开始进行诱导分化（图1、2）。bFGF预诱导组与未预诱导组相比，细胞数量增加。两组细胞数分别为109.200±5.514和89.200±7.208，差异有统计学意义（P% f) n3 O6 }9 i2 }

　　2.2免疫细胞化学检测各实验组于诱导3 d、7 d后出现不同数量的NSE、TH阳性神经元样细胞，GFAP阴性。特异标志阳性细胞与阴性细胞相比，胞体较小，呈圆形或卵圆形，部分细胞有短突起或/和较长、伸向两极的突起，胞浆内有棕黄色颗粒，胞核深蓝色，有些带有小突起。阴性细胞，胞浆不着色，一般胞核较大，扁圆形，呈浅蓝色（图3～5）。
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　　图1原代培养第5 d MSCs的3种细胞形态：梭形、球形、巨大扁平形（倒置显微镜100）（略）; \  C% b* d- c* M/ k) q) I

　　图2原代培养第6 d MSCs接种后呈现多个细胞的巨大细胞克隆（倒置显微镜100）（略）0 ]; y8 @: f( X& u& |/ p+ w8 p: u
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　　2.2.1各组不同时点预诱导后NSE阳性细胞率比较见表１。对照组可见少量NSE阳性细胞，3 d、7 d的NSE阳性细胞率差异无统计学意义（P>0.05）。bFGF预诱导组中各实验组可见数量较多的NSE阳性细胞，与对照组相比NSE阳性细胞率明显增加，差异有统计学意义（均P

　　图3G G组，箭头示NSE阳性细胞（400）（略）/ D& w& _% L2 x4 z7 |" ^: @& a; E

　　图4G G组，箭头示TH阳性细胞（400）（略）, P% ~5 J. a3 u" E4 N2 l& h! p/ Q3 `

　　图5G G组，GFAP阴性细胞（400）（略）
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　　表1各组及不同时点bFGF预诱导后NSE阳性细胞率比较（略）
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　　注：与对照组比较*Ｐ
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　　2.2.2各组及不同时点预诱导后TH阳性细胞率比较未预诱导组中对照组、GM1组和GDNF组均未见TH阳性细胞，G G组可见少量TH阳性细胞。G G组预诱导与未预诱导相比，3 d TH阳性细胞率分别为（12.169±1.315）%、（9.316±0.956）%，7 d TH阳性细胞率分别为（15.168±2.276）%、（12.305±1.778）%，预诱导后明显增高，差异有统计学意义（均P6 F0 E; ~3 @8 g0 O) W$ ~- d
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　　3讨论6 o; {  o2 |& x+ J; O! F5 u5 }7 y

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　　在神经系统发育的不同阶段，神经元的特异性标志不同。NSE出现在神经元和神经内分泌细胞中，是早期神经元的特异性标志，也是神经外胚层肿瘤最敏感的免疫标志。TH是脑内DA能神经元的特异性标志之一。因此，本实验选择NSE和TH，对MSCs诱导分化后的“神经元”进行检测。- s! m4 K: g4 x$ J
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　　本实验首先应用bFGF对MSCs进行预诱导，结果表明与未预诱导组相比，细胞数量明显增加。bFGF预诱导组，大部分细胞形态逐渐变成细长梭形，排列规则；部分原来宽大扁平的MSCs胞质向核收缩，细胞体积变小，折光性增强，逐渐变成小的卵圆形或圆形，不带突起或向两极伸出突起，类似于神经元形态。证明bFGF可明显促进MSCs向神经元分化。bFGF预诱导组中各组可见数量较多的NSE阳性细胞。各组与对照组相比NSE阳性细胞率明显增加。说明bFGF、GDNF、GM1联合诱导能够明显提高MSCs向神经元样细胞的分化率，并能延长神经元样细胞的生存时间。

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　　张卉等［ 4 ］研究发现单纯GM1不能诱导MSCs分化为神经元样细胞，bFGF能诱导MSCs分化为神经元样细胞，GM1和bFGF联合诱导能提高MSCs向神经元样细胞的分化率。. ?- X, g5 q% L" l( b! B' Z4 u' s
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　　bFGF的受体系统为双受体系统，有低、高亲和力受体。Tassi等［ 5 ］认为，bFGF必须先与细胞表面低亲和力bFGF受体及胞外硫酸己酰肝素蛋白聚糖结合，然后连接、激活细胞表面高亲和力bFGF受体，高亲和力bFGF受体出现二聚化和自磷酸化，自磷酸化的bFGF受体顺次激活下游能与bFGF受体上SH2区结合的信号转导分子；而且，激活的bFGF受体被转接蛋白连接到RAS/MAPK，完成细胞外信息向细胞内传递，而发挥其生物活性作用。在体外培养体系中，bFGF和组蛋白H1紧密结合，激活蛋白激酶CKII，参与不同的基因表达调控［ 6 ］。1 X# s) A; U( A4 N4 u  M
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　　神经营养因子能够与低亲和力神经生长因子受体p75NGFR 和酪氨酸激酶（Trk）受体结合，将有关信号转导至细胞浆或细胞核内从而发挥其细胞调控作用。Stammer等［ 7 ］和Sanchez等［8 ］研究表明当神经生长因子和脑源性神经生长因子与细胞膜上的TrkA和TrkB受体结合后可以激活一系列细胞生物反应，促使MSCs从未分化状态的细胞向成熟神经元分化和发育。- A' M  y- K( s/ T2 T) N
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　　1993年Lin等［9 ］在实验中证明GDNF对发育及成熟的DA能神经元有保护、修复作用，可增强体外培养的DA能神经元对DA的摄取，促进DA能神经元的分化。GDNF对于损伤后的DA能神经元具有修复作用。当培养的神经元中加入1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)，GDNF不能阻止后者的损伤作用，但去除MPTP后，GDNF能阻止DA能神经元死亡，促进恢复。  W. y/ o( Z* w

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　　GM1是高度集中在中枢神经系统的一类涎糖神经鞘脂，为正常神经细胞膜成分。主要位于髓鞘、神经元细胞膜和轴突，所以在脑内含量丰富，外周神经如坐骨神经、股神经也含有GM1。在正常发育过程中，GM1可能参与神经元的生长、分化和表型的表达，以及细胞的迁移和神经生长锥的定向延伸。在病理过程中如缺血、缺氧常伴有脑内GM1含量下降和神经细胞受损，补充GM1可以防止损伤造成的神经元凋亡，增强突触的可塑性，改善学习记忆。如GM1可以明显减少海马切除、皮质损伤、衰老和坐骨神经远端切除后引起的胆碱能神经元的丢失［ 10 ］。. ^( X# ?1 }7 C
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　　本实验中MSCs诱导分化后对照组、GM1组和GDNF组均未见TH阳性细胞，G G组可见部分TH阳性细胞，且于7 d TH阳性细胞率与3 d时相比显著增高，经bFGF预诱导后这种作用更显著。故推测bFGF、GDNF、GM1都可能与细胞外基质相互作用，调节MSCs行为，最终使其向神经元、DA能神经元样细胞分化。随着诱导时间的延长，TH阳性细胞率增加，可能是各种因素引起的多种信号传导途径相互作用，导致分化基因的表达，产生了长期调节作用。但是，就神经分化而言，MSCs转化后能够表达神经细胞特异蛋白，仍不能证明其就是具有正常功能的神经元，对其进行细胞功能测定，包括分泌的化学递质、突触结构、电生理活动等的深入研究后，才能证实为真正的转分化，这些还有待于今后进一步研究探索。
      【参考文献】' K" S( V2 |& m6 D9 J$ `' l
　　［1］张克忠，蒋雨平，赵延欣，等.骨髓基质干细胞对lactacystin帕金森病大鼠的神经保护作用［Ｊ］.临床神经病学杂志,2006,19:290.3 l! f3 K4 ?0 X. V5 e

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　　［2］王磊, 曾水林, 朱建宝,等.帕金森病大鼠海马区增殖神经干细胞分化情况的研究［Ｊ］.临床神经病学杂志,2006,19:293.

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　　［3］Azizi SA,Stokes D,Augelli BJ,et al.Engraftment and migration of muman bone marrow dtromal cells implanted in the brains of albino rats similarties to astrocyte grafts［Ｊ］.Proc Natl Sci USA, 1998,95:3908.

　　［4］Zhang H, Wang JZ, Sun HY, et al.The effects of GM1 and bFGF synergistically inducing adult rat bone marrow stromal cells to form neural progenitor cells and their differentiation［Ｊ］.Chin J Traumatol, 2004,7:3.

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　　［6］Amalric F, Bouche G, Bonnet H, et al.Fibroblast growth factor2 (FGF2) in the nucleus:translocation process and targets［Ｊ］.Biochem Pharmacol, 1994, 47:111., q+ ?$ y' T, w& h  Q* w
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