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作者：李树岩 李淑梅 董明慧 常影作者单位：吉林大学第二医院心内科，吉林 长春 130041
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2 M o" N. b% m0 ^ 【摘要】 目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）基因转染同种异体骨髓间充质干细胞（MSCs）对猪急性心肌梗死（AMI）血管再生和心功能的影响。方法 体外分离、纯化、培养猪骨髓MSCs，以PCNA染色标记细胞；制备、抽提、纯化质粒pdVEGF。用球囊堵闭及拉伤冠状动脉法建立AMI模型1 w后，随机将其分为4组（n=4），进行经冠状动脉途径移植MSCs和/或VEGF转染。组Ⅰ：给予转染VEGF腺病毒的MSCs移植；组Ⅱ：单纯MSCs移植；组Ⅲ：VEGF转染；组Ⅳ：DMEM对照组。4 w后行免疫组化和超声心动图检查。结果 组Ⅰ及组Ⅱ在梗死区及缺血区均可见较大量的PCNA标记的移植细胞。Ⅷ因子染色阳性的新生血管密度：组Ⅰ＞组Ⅲ＞组Ⅱ＞组Ⅳ。4 w后LVEF值：组Ⅰ＞组Ⅱ＞组Ⅲ＞组Ⅳ（均P＜001）。结论 VEGF基因转染同种异体骨髓MSCs移植猪心肌梗死区及缺血区促进血管再生及心肌细胞的再生，改善心功能
( S* n! q# j/ m5 K 【关键词】移植；骨髓间充质干细胞；基因转染；血管内皮生长因子；心肌梗死；猪! Z7 g8 W% K6 g% t+ b7 ?
急性心肌梗死（AMI）后心肌细胞的丧失不能从经皮冠状动脉介入治疗（PCI）或冠状动脉旁路移植术（CABG）中得到补充，因此心梗后不可避免地出现心力衰竭。近年来骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）在治疗缺血性心脏病方面受到关注。有研究证明MSCs能分化为心肌细胞，MSCs移植能促进血管再生并改善心功能〔1，2〕。而用人VEGF基因转染同种异体猪的MSCs治疗AMI尚少有报道。本研究利用体外构建重组VEGF腺病毒质粒PAdshuttle/VEGF转染猪的骨髓MSCs，经冠脉途径移植入猪的梗死相关动脉，探讨VEGF基因联合MSCs移植对缺血心肌的血管再生作用。# R& b. Y1 ]9 R
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1 材料与方法$ j9 r2 D6 u0 ?: k9 l4 y
! {' T( e$ C. E+ z/ _) {) o; L 11 材料: s* t& H8 B( q
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限制性内切酶、T4 噬菌体DNA 连接酶、感受态大肠杆菌JM109 （TaKaRa 公司）；重组腺病毒载体构建及腺病毒扩增采用pAdeasy1腺病毒系统，胎牛血清和DMEM培养基以及细胞转染试剂（Invitrogen公司），质粒小量提取和DNA片段回收试剂盒（鼎国生物公司）。含人VEGF cDNA的克隆载体系汕头大学尹小光博士惠赠。6 ^: `0 q% x! t/ {
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12方法
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" G/ n# {: J5 A6 W6 y 121 AMI动物模型的建立+ u; Q$ G2 m' }+ w& V+ x$ b
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健康中国小型猪，体重20～30 kg，雌雄不限。速眠新、氯胺酮静脉麻醉。将猪仰卧放于DSA导管床上，固定四肢，建立静脉通路，给予阿托品1 mg肌注。消毒腹股沟部位，经皮穿刺或切开分离股动脉，放置动脉鞘，先行冠状动脉造影，然后用6FJL35指引导管放于左冠状动脉口部，将导丝送达前降支动脉（LAD），沿导丝送入20或25 mm15 mm球囊至第二对角支以远1 cm处，充盈球囊堵闭LAD，球囊封堵之初，先给予适应3～4次，每次10～20 s，以减少室颤的几率，之后完全打开球囊堵闭血管，低压力球囊充盈时，前后小范围拉伸球囊造成动脉内膜损伤，快速造成心梗模型。
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122 猪骨髓MSCs的分离、纯化及培养
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建立心梗模型前，无菌条件下髂后上棘穿刺，用含肝素盐水的注射器抽取骨髓10～20 ml，加入等量的无血清的DMEM稀释，然后1 000 r/min离心10 min，弃去上清，将细胞缓慢加至预先配制好的Percoll分离液的离心管中，2 500 r／min离心30 min。小心吸取中间交界面的单核细胞层，加入完全培养基(LDMEM 10胎牛血清 100 U／ml青霉素 01 mg/ml链霉素)，将细胞接种于6孔培养板。24 h后换液去除未贴壁细胞，此后每3 d换液1次。14 d后细胞基本融合，胰酶消化细胞，制成单细胞接种传代。
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) [6 s# w/ d' r% B: v0 w, S1 j$ h 123重组VEGF腺病毒的构建
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! I/ @' ^8 l2 q0 q0 m* N$ L5 L- d 用限制性内切酶 Xba I和XhoⅠ将VEGF cDNA片断自pdVEGF质粒中酶切下来,在 T4 DNA 连接酶的作用下插入穿梭载体pShuttleCMV 上。阳性克隆小量扩增，质粒DNA提取，然后再用PmeⅠ酶切、与质粒pAdeasy1 转化BJ5183大肠杆菌,进行同源重组制备重组腺病毒载体质粒。重组阳性的质粒大量扩增，分离质粒DNA,取10 μg DNA，用PacⅠ酶切，采用脂质体转染的方式转染 HEK293细胞，产生复制缺陷型重组腺病毒PAdshuttle/VEGF。重组腺病毒滴度测定采用病毒DNA的OD值计算病毒颗粒/ml。重组腺病毒的鉴定:重组腺病毒载体转染HEK293细胞 7～10 d后可见细胞变圆、肿胀,有少量浮起。将细胞培养板置于-70℃冰箱，反复冻融3次 冻融获得的上清中含有大量重组腺病毒颗粒 AdVVEGF。提取重组腺病毒感染的COS7细胞,分离总RNA进行 RTPCR。
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124 PAdshuttle/VEGF基因转染猪MSCs; F' Z* V5 `. ^+ B
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猪骨髓MSCs培养至80％融合，弃去含血清的培养基，加入含有1109VP/ml的无血清DMEM，CO2孵箱中保温1 h，然后弃去病毒液，换上含血清的完全培养基，24 h后，固定细胞，进行VEGF的免疫组织化学染色。常规免疫组织化学(SP)染色：滴加过氧化物阻断剂，室温10 min；滴加正常羊血清，室温10 min；滴加鼠抗VEGF(1∶100)，4 ℃过夜；滴加通用型IgG，室温10 min；链霉卵白素过氧化物酶溶液，室温10 min；以上各步骤均用0．1 mol／LPBS洗3次，每次3 min。DAB显色，常规脱水、透明和封片。对照染色，以正常羊血清替代一抗进行免疫组化染色。6 Z4 U8 p4 `. v9 v+ r
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125 细胞移植及分组 n4 g4 A7 J7 l6 d6 z2 d
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心梗模型建立后1 w，再次将猪麻醉，无菌条件下股动脉穿刺或分离股动脉，造影见LAD远端完全闭塞。6FJL35造影导管放于冠状动脉口部，沿导丝送入20 mm或25 mm OTW球囊放于LAD远端，将球囊充盈打开堵闭LAD，随机分为4组（n＝4）。组Ⅰ通过球囊内腔注入转染VEGF基因的MSCs细胞100 μl；组Ⅱ注入未转染的MSCs 100 μl；组Ⅲ注入VEGF基因质粒50 μl；组Ⅳ注入不含血清的DMEM 100 μl作为对照组。
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2 |$ j0 ^# K, I1 u 126 超声心动图检查
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0 e3 J; k$ J% t' ^ 心肌梗死制模前及5 w后行心脏超声心动图检查，采用二维超声取左室长轴切面测量左心室舒张期末直径和收缩期末直径。计算左心室射血分数（EF）、左心室短轴缩短率（FS）。! b4 u2 `/ l+ z% `
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127 病理学检查! I/ C6 x3 r! y- h8 n
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实验后4 w处死动物，取出心脏。生理盐水冲洗，分别切除左、右心房及右心室，在心肌梗死区及缺血区切下4 mm4 mm心肌组织，用4％中性甲醛磷酸盐缓冲液固定，石蜡包埋、切片。进行免疫组化（PCNA染色，Ⅷ因子染色）和HE染色检查。; `6 w2 d1 z0 x5 u: x& t$ k
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128 新生血管密度检测
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/ [. L! [/ K- y 每组取3只猪，每只猪随机取3张切片，选2个视野计算3个视野内Ⅷ因子阳性染色的内皮细胞形成的新生血管平均数。
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- S; S& f7 X* i a 13统计学分析" G4 {8 ~6 I2 @
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用SPSS10统计软件对数据处理，以x±s表示，均数间用单因素方差分析。
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/ _6 {) v. t3 x3 V. {+ a 2结果
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21 VEGF重组腺病毒的鉴定) l% {* c- z7 U$ {
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以1109VP/ml的浓度转染真核表达细胞系COS7，24 h后收集细胞，提取细胞总RNA，逆转录cDNA，然后采用VEGF特异引物进行PCR扩增。结果显示，转染重组病毒的COS7细胞内的mRNA水平明显高于未转染组。说明我们构建的重组腺病毒能够在宿主细胞内表达外源基因（见图1）。
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3 Z4 P3 b% ~ }. g& q 22骨髓MSCs的形态学观察
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原代MSCs接种24 h，仅见少量贴壁细胞，圆形或短梭形，48 h贴壁细胞逐渐增多，可见分散的MSCs小集落，细胞形态为长梭形，7～8 d后细胞基本融合。免疫组织化学染色显示转染AdVVEGF重组腺病毒的MSC的VEGF表达呈阳性（见图2）。而且在转染后2 w其表达水平没有衰减。表明骨髓MSCs对重组腺病毒具有较好的易感性，可获得较高的转染效率和表达活性，能持续一定时间表达VEGF，有利于诱导疗性血管生成。
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23 心肌梗死区域病理学检查
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" d( Y4 v% d. f; F( ] n" V. ] 心梗组织HE染色可见心肌细胞溶解消失，代之以瘢痕纤维组织，心肌细胞肿胀，细胞核溶解消失。对照组未见新生的心肌细胞，而组I及组Ⅱ除上述特点外可见新生的细胞，PCNA及myogenin染色可见新生的心肌细胞（见图3）。Ⅷ因子染色结果组I及组Ⅲ有较多的新生血管内皮细胞、组Ⅱ有少量Ⅷ因子染色阳性血管内皮细胞、对照组则偶见新生的内皮细胞（见图4）。表1 各组术后1个月LVEF值比较(略)
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; I7 h8 U9 ~: ]+ ?/ }$ W& l( J( p, j 24超声心动图检查
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7 m; p# Q0 U8 R; X M2 f 细胞移植或VEGF基因转染前各组心功能指数LVEF无显著差异，术后4 w LVEF组Ⅰ及组Ⅱ较对照组均显著增加，组I改善最为明显（见表1）。
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3 讨论7 k1 E/ O6 z' A, c; m0 |; ]
- Q+ {( s# ~; d; i MSCs是骨髓中具有多向分化潜能成体干细胞。体外易于分离、培养及扩增，在不同的微环境下可分化为成骨、软骨、脂肪、肌腱及心肌细胞〔1〕,心肌梗死后干细胞的移植可提高心功能，改善心肌梗死预后。本研究采用VEGF基因转染同种异体MSCs经冠脉途径移植入猪心肌梗死部位，结果显示，在梗死和缺血区出现PCNA染色阳性及myogenin染色阳性细胞，而且新生血管数目明显高于单纯细胞移植组和基因转染组，提示移植的细胞在梗死缺血区存活，新生血管密度最大，心功能指数明显好于对照组。有文献报道MSCs是低免疫源性干细胞〔3〕，同种异体MSCs能在异体存活且不引起排斥反应，其机制可能与T细胞自身免疫耐受有直接关系〔4，5〕，人体实验结果显示同种异体MSCs可在异体内存活，分化成心肌样细胞，而且改善了心功能。VEGF基因转染干细胞促进了血管的再生，而且可延长干细胞在梗死瘢痕区的存活时间。
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VEGF是特异性作用于血管内皮细胞的一种生长因子，他能强烈诱导血管形成，对维持内皮细胞的存活发挥作用〔6〕。人类至少有4种VEGF，分别由121、165、189和206个氨基酸组成；其中VEGF165是发挥生物学效应的主要成分〔7〕。本研究证实VEGF基因成功转染MSCs，转染率高而且获得了稳定地表达，表达的VEGF具有生物活性。从分组情况看，VEGF联合MSCs除可见大量PCNA染色阳性细胞外，新生血管密度最大，移植后心功能指数改善明显，说明细胞移植和基因治疗相结合可能是治疗缺血性心脏病的最佳方案。
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虽然干细胞及VEGF等生长因子治疗缺血性心脏病动物实验获得了极好地治疗效果，但真正用于临床尚有大量工作需要完成，包括生物在体实验安全性及有效性等。% B9 z4 o. c, \. a( k3 U8 M0 o5 W
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发表于 2009-3-3 12:35
发表于 2009-11-4 23:29
