分离了一些"脐血干细胞"，但是养出来的都是漂浮的要不就是死的

西瓜太郎

9 f! I- O/ n, _: p! {5 _9 l! W! x* x  I5 J: M2 p
前天分离了一些脐血干细胞，但是养出来的都是漂浮的要不就是死的。。不知道怎么回事，是不是操作有什么问题，具体如下：
& K3 q; a* A! m+ {$ |1、收集脐血50+ml，加PBS 1：1稀释，后与人淋巴细胞分离液1：1离心,2000转*20分钟
0 H0 b/ M1 ?6 b" w3 U2、收集第二次的絮状层，用培养液稀释离心。1000转*10分钟*2次，收集最底层的白色物。
8 _* k4 i# b0 X3、与T25 培养瓶中培养。. U6 A, d2 n( E
       可是问题来了，第二天细胞没见到贴壁的，几乎全是圆的或是死的。。。。。。3 [& M1 |: v) _9 \) c
是不是离心的时候出现了什么问题还是。。/ J" h" k. ]; G& x+ O2 s
很奇怪的是：第一次养细胞只用了第一步的，结果还是有点细胞的，可见一定量的梭形细胞。- p/ M# }9 F3 E  n$ g2 Q8 z
我怀疑是不是我把干细胞从第二步的时候给倒掉了啊？ 郁闷。。。; I6 b0 Q0 F; y. f$ K& l- E5 I5 R9 N
请高手指点一下小弟，先拜谢了

西瓜太郎

新手实在是想不到怎么办，谢谢指点啊
- [% p4 d; P) R; i. p" [9 b

luomx07

    之前我也养过几次，可惜没养出来，所以帮不了你% ?8 u+ W1 j$ {
    一起等待高手指点吧

deron

没养过
5 W7 @7 J( x1 f. f3 S但听说脐血干细胞的成功率很低，只有20%~30%

why121

这玩意是很难养出来 完全看运气 前72h最好别去看它 3天后再看下有没有贴壁的

西瓜太郎

跪求高手出来指点啊

chuanbaozang

首先想知道你养脐血里的什么细胞啊？间充质干细胞？# ?9 n' h8 `- R9 X
那个数量太少了，挺难的
  C: V' Q' U$ K( h( c/ y2 u. q但是我觉得你的这个操作过程是在分离培养淋巴细胞，CIK细胞不就是这样培养的嘛。
6 s/ X9 g, Y- q9 o9 {淋巴细胞中的DC细胞可以贴壁，不过数量也不多，CIK细胞是悬浮的，小而圆，所以，我认为你在养的是脐带血中的淋巴细胞

呼吸

1、应该先把血浆从血液中分离出去大约是2500--2800RPM（根据血质不同，时间和转数相应调整）
' X6 o7 A* U; ]7 W% E2、去掉血浆，然后用生理盐水稀释剩余的部分，与人淋巴细胞分离液2：1离心。4 a! s# b/ Z  _: H0 _" l$ m; H5 R6 u
3、吸取中间的单核细胞（白膜层），放入离心管中，加入生理盐水定容继续离心。
+ }) O, B! B: |4、倒掉上清，用裂解水把残余的红细胞裂解掉，注意掌握好时间，别把白细胞也一起裂解掉了。4 p0 N4 e- D  b/ g+ g4 X: M0 }
5、根据提取的单核细胞的量，用适当的培养基培养。+ J  m9 \2 h  }+ O6 F
注：所说脐带血干细胞很复杂，含有多种细胞，主要是造血干细胞，都是以悬浮的形式存在的，能够养出脐带血间充质干细胞是有概率的，大约1/4的脐带血才能养出来间充质，这也要用适当的培养基。大概过程仅供参考，谢谢。

静水流深

早已成功分离出脐血干细胞，相对还是比较好养的 但分离的方法与你的有点区别 详情如下. g. {1 Q) n9 r1 Z- B6 i: Q
脐血由于量较大 我通常不用PBS稀释 与Ficoll分离液 2:1  将脐血小心移入分离液液面上 之后离心 水平离心 2000r 20min  离心后出现分层现象 三层或四层 取中间层（第二层白膜层）再加生理盐水冲洗离心3次 1700r 10min  后两次1000r 8min  之后转入培养瓶 置于温箱培养 通常在3-7左右才能看到贴壁细胞 之间不要移动  元代的杂细胞较多 在贴壁之后可以换液培养 之后的就与其他细胞培养无恙 希望对你们有所帮助 ！

静水流深

回复 静水流深 的帖子# Z0 i) c# B3 L& V

3 k- n3 r4 ]/ R) U: a! O8 m分离元代时可以加入红细胞裂解液 但我通常不加