放射性核素骨显像动态检测组织工程化骨血管化的价值 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:36 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：付志厚, 王爱民作者单位：第三军医大学附属大坪医院骨科，重庆市 " y  J0 W- ]1 P# m* E$ J

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      【摘要】  ［目的］放射性核素骨显像动态检测评价组织工程化骨血管化与骨代谢的价值。［方法］取大白兔24只，抽取骨髓，行骨髓间充质干细胞分离、培养与骨向诱导。双侧股骨髁制作0.6 cm×1.2 cm的骨缺损，将诱导后的骨髓间充质干细胞与珊瑚羟基磷灰石复合植入左侧骨缺损处为实验组，右侧单纯植入珊瑚羟基磷灰石为对照组。术后4、8、12周分别行静态放射性核素骨显像检测，用ROI计数计算不同时间点的ROI平均计数。［结果］结果术后4、8、12周实验组ROI计数(单位像素)均较对照组有显著性增高。实验组ROI计数随时间的延长，呈明显的上升趋势，术后8周开始增长放缓；对照组ROI计数术后8周增长缓慢，8周后开始增长加快，两组均在12周达到峰值。［结论］骨髓间充质干细胞诱导后与珊瑚羟基磷灰石复合可有效的修复股骨髁松质骨缺损。放射性核素骨显像可动态检测组织工程化骨血管化及骨代谢变化。 8 l# A5 m' I! U* E! s
      【关键词】放射性核素骨显像;  血管化;  骨髓间充质干细胞;  骨缺损;  珊瑚羟基磷灰石
   Values of radionuclide bone imagingto dynamically monitor revascularization of tissueengineered bone graft in repairing bone defect of rabbits∥FU Zhihou, WANG Aimin.Department of Orthopaedics, Affiliated Daping Hospital of the Third Millitary University, Chongqing400042, China
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Abstract：［Objective］To dynamically monitor revascularization and metabolism of tissueengineered bone graft in repairing bone defectsby radionuclide bone imaging.［Method］Twentyfour healthy New Zealand rabbits were studied. Mesenchymal stem cells(MSCs) were separated and cultured from bone marrow.Cancellous bone defects(0.6 cm1.2 cm) were created on bilateral femoral condyles in rabbits. Thecompound of coral hydroxyapatite ceramic(CHA) and defects were treated with the induced osteoblasts inplanted into the left defects (experimental group). While CHA alone was used for the right (control group). The counts of regions of interest( ROI) was evaluated byradionuclide bone imaging at 4,8 and 12 weeks postoperatively.［Result］ROI in the experimental group was significantly higher than that of control group at 4,8 and 12 weeks postoperatively. ROI in either group had a tendency to increase with time. Eight weeks postoperatively, ROI in experimental group tended to increase at a lower speed, while ROI in control group had a tendency to increase at a higher speed. ROI in either group reached a peak at 12 weeks postoperatively.［Conclusion］The tissueengineered bone graft is an effective method for repairing cancellous bone defects. Radionuclide bone imaging can dynamically monitor the changes of revascularization and metabolism of tissueengineered bone graft.) p6 [# p: x6 ]+ R7 g) R

Key words：mesenchymal stem cells;revascularization;mesenchymal stem cell;bone defect;tissueengineered bone1 z. W+ @$ q6 k1 p4 s

随着组织工程学的迅速发展，应用种子细胞复合生物材料修复骨缺损已有较多的报告。但组织工程化骨血管化及骨代谢应用X线、组织学技术来评价缺乏定量分析。本研究以骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)为种子细胞骨向诱导后与珊瑚羟基磷灰石复合修复兔股骨髁松质骨缺损，应用放射性核素骨显像来评价组织工程化骨血管化与骨代谢的动态变化。: C- w- x& C& a9 S; @

1材料与方法
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1.1材料

　取5～7个月龄健康清洁级新西兰大白兔(济南军区总医院动物中心，编号：SCKX 204057)24只，体重2.5～2.9 kg，雌雄不限。珊瑚羟基磷灰石为颗粒状5P10R（直径1～4 mm），孔径大小400～500 μm，空隙率30%～70%，由北京意华健科贸有限公司提供。

1.2方法
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1.2.1骨髓MSCs的分离、培养与骨向诱导无菌条件下于兔股骨大转子下穿刺，抽取骨髓约5 ml后缓慢注入含10 ml淋巴细胞分离液的离心管中；2 500 r/min离心15 min,吸取界面层细胞,将细胞悬液按4105/mL接种于75 ml培养瓶内,按贴壁培养法分离骨髓MSCs。取第4代骨髓MSCs将基础培养液更换为成骨诱导培养液（地塞米松10-8mol/L  甘油磷酸钠10 mmol/L  维生素C 50 mg/L， pH7.30）。置37℃、 5%CO2、饱和湿度孵箱中培养。每3 d换1次液。诱导后于28 d分别行茜素红染色、ALP测定、I型胶原组化染色鉴定成骨细胞。
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1.2.2体外组织工程化骨的构建取同种异体第3代骨髓MSCs，细胞密度调整到4106/ml，加入成骨诱导培养液盖过材料，放置37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养，次日改换成骨诱导培养液，继续孵育4 d。/ P* c9 `4 @- W( ]5 p1 `- e% y& P
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1.2.3松质骨缺损模型的建立与修复速眠新耳静脉麻醉后，无菌条件下取兔左侧股骨远端外侧切口，显露股骨外髁，切去骨膜。用直径0.6cm环锯在股骨髁由外髁向内髁制作一0.61.2 cm的松质骨穿通性骨缺损，植入体外构建的组织工程化骨为实验组。同法制作右侧股骨髁骨缺损，仅植入珊瑚羟基磷灰石为对照组。% C  I8 n, _" a1 E& Q2 d  Y3 k2 x

1.2.4放射性核素骨显像术后4、8、12周分别取动物8只，根据体质量（18.5 mBq/kg）耳缘静脉注射99mTcMDP,3 h后, 速眠新耳缘静脉麻醉，固定四肢,应用低能高分辨探头距离双侧股骨髁10 cm,以0.2桢/min采集一幅静态图象。以双侧股骨缺损处1 cm2 cm大小的矩形为兴趣区(regions* f# c$ N1 w  g4 M: j$ p- I  j

of interest,ROI),用ROI计数(单位像素)计算不同时间点的ROI平均计数。, q# d" t" S1 {5 B9 a) x  \
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1.2.5统计学分析使用SPSS 12.0软件统计处理，计量资料以±s表示，组之间采用配对t检验，组内采用方差分析及q检验。! |9 a6 A9 E- m9 A0 o% D
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2结果

2.1一般观察1 w4 Y! Z/ _; F/ I. t

术后动物均未出现切口红肿、渗血渗液等情况，术后1周恢复正常活动。

2.2核素骨显像结果* [: T/ Y9 x% j8 b! J, {' u9 y
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术后12周静态核素骨显像结果见图1，由图1可见左侧股骨髁同位素较右侧浓聚。

术后实验组与对照组不同时间点ROI值平均计数结果见表1。术后4、8、12周实验组ROI平均计数均较对照组高，有显著性差异(P

2.术后不同时间点之间比较，b P＜0.05

由图2可见，实验组与对照组ROI平均计数随着时间的延长呈明显的上升趋势，组内比较有显著性差异（P＜0.05）；但实验组术后8周内ROI平均计数上升斜率大，术后8周开始上升放缓，术后12周达到峰值；而对照组术后8周内ROI平均计数上升斜率小，术后8周始上升斜率加大，在12周达到观察期内峰值，但仍低于实验组。图1术后12周放射性核素骨显像示左侧股骨髁同位素较右侧浓聚

图2不同时间点ROI平均计数曲线图( J5 ?9 l( e- t* J0 N$ }) {7 N8 `7 W! o

3讨论
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骨组织工程包括三大要素：种子细胞、生物材料及生物活性因子。骨髓MSCs是骨组织工程中常用的种子细胞，经分离、诱导后与生物材料复合构建组织工程化骨，移植体内后依靠种子细胞的成骨作用及生物材料的降解吸收，最终形成新生骨组织。本研究应用同种异体骨髓MSCs与CHA复合修复股骨髁松质骨缺损，术后各个时间点实验组ROI计数均明显高于对照组，表明组织工程化骨移植后新骨生成与代谢活跃，血供丰富。

　放射性核素成像的基本原理是根据人体骨骼中含有羟基磷灰石等无机盐胶原纤维等有机物的特点，以静脉或口服途径将亲骨性放射性核素及其化合物摄人体内，通过血液循环，与骨中羟基磷灰石结晶体表面上不同的价数正负离子进行离子交换和化学吸附，或与骨中未成熟的胶原结合而进入骨组织并显像。骨骼摄取骨显像剂的影响因素有：(1)局部骨组织血液供应系统的完善和骨内血液的流动率［1］；(2)骨代谢活性，首要因素是骨的更新速率；(3)与类骨质和未成熟胶原对99mTcMDP的亲和力及碱性磷酸酶的促进作用有关［2］。99mTcMDP是常用的放射性核素，静脉注射后 4 h后，约有 1／2通过吸附方式与晶体表面结合沉积在骨骼内，余者由肾脏迅速排出体外。因此骨显像中放射性核素的分布不仅能显示骨骼的形态，而且可以间接反映局部骨的血流灌注量、骨矿物质代谢、骨的更新速率和成骨活动情况；血供丰富，成骨活跃，骨显像上表现为放射性浓聚，反之则表现为放射性稀疏或缺损。Smeele等报道放射性核素骨显像检测的准确性可达100％［3］。
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本研究实验组和对照组随时间变化两组ROI计数都有上升趋势，但实验前8周ROI计数增幅迅速，8～12周增幅趋缓，结合组织学变化分析，表明移植物血管化、骨代谢活性前8周为快速发展阶段，8～12周已进入缓慢发展渐趋成熟阶段。对照组术后8周ROI计数上升缓慢，8周后增幅迅速，12周均达峰值，与其它学者的报告结果［4，5］一致。本研究组织工程化骨组与对照组ROI计数的峰值时间点与文献报告［5］相符，而与吴雪晖等［6］报告的峰值时间分别为4、8周不同，这可能与生物材料的不同或和修复的骨缺损部位不同有关。
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本研究应用同种异体兔MSCs植入修复松质骨骨缺损，术后放射性核素骨显像示骨代谢与新骨生成活跃，并未影响移植骨的修复能力，与窦强兵等［7］应用同种异体MSCs复合纤维蛋白修复骨缺损的组织学结果一致。但对同种异体MSCs的免疫反应及其对骨修复的影响，尚有待于进一步的探讨。
      【参考文献】
［1］  Holmberg S, Thorngren  KG. Preoperative 99mTcMDP scintimetry of femoral neck fractures［J］. Acta Orthop Scand, 1984, 4:430-435.
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［2］  Moyi S,Hongeai D,Tiangiu M, et al. Radionuclide observation on composite grafts of allogeneic bone matrix gelatin and partially deproteinized xenogeneic bone［J］. Orthop  J Chin, 2003,12:837-839.% o  ~% ~4 p) T1 i) b- A) o

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［3］  Smeele LE, Hoekstra OS, Winters HA, et al. Clinical effectiveness of 99mTc-diphosphonate scintigraphy of revascularized iliac crest flaps［J］. Int J Oral Maxillofac Surg, 1996, 5:366-369.' V* [/ X$ V: x) E. z6 [! g: B
, ~/ S: G0 u. E. s* X

［4］  杨志明，樊征夫，解慧琪，等. 组织工程化人工骨血管化研究［J］. 中华显微外科杂志， 2002，2:119-122.# o: _5 d/ Q. p+ B/ F( \4 q; S" U

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4 I/ G, j, j+ L' j
［5］  林红，方涛林，戴文达，等. 放射性核素骨显像评价血管化组织工程骨修复兔长段骨缺损［J］.中国临床医学，2007，3：416-419.  y/ `$ T! \- `& G# R% u

［6］  吴雪晖，谢肇，许建中，等. 放射性骨显像在组织工程骨修复骨缺损实验中的应用［J］. 重庆医学，2007，9:777-779.6 z; A4 z% L# a

' A: n+ o0 @3 D, v" a$ h2 f1 c# c

［7］  窦强兵，孔荣，朱六龙，等.同种异体间充质干细胞复合纤维蛋白修复骨缺损［J］. 中国矫形外科杂志，2006，10：766-768.

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