rhBMP2和rhVEGF转染ADSCs后体外表达及诱导骨缺损成骨修复的实验研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:37 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：杨在亮，张波，周继红，黄宏，张良，刘大维作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室，创伤、烧伤复合伤国家重点实验室，重庆 400042 1 X3 O- o. {4 F( L! W2 e! }

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      【摘要】  目的观察重组人骨形成蛋白2（rhBMP2）和血管内皮生长因子（rhVEGF）转染脂肪源性干细胞（ADSCs）后的体外表达情况，并以含该转染体系的组织工程骨进行大动物负重骨缺损的修复研究。方法将外源性基因rhBMP2和rhVEGF通过脂质体LipofectamineTM2000介导的方式转染第四代ADSCs，以G418筛选出阳性克隆并扩大培养后，用RTPCR和SABC免疫组化法在转录和蛋白质水平观察其转染后第2天和第4周表达情况。建立小香猪自体前肢尺骨中段1.5cm骨缺损模型，分3组进行对比试验：(A组)转染了生物活性因子的ADSCs与脱细胞骨基质材料（ACBM）复合而成新型组织工程骨植入修复组；（B组）未转染生物活性因子的ADSCs复合ACBM植入修复组；（C组）未处理组。以X线和组织切片评价其修复效果。结果转基因ADSCs在转染后瞬时和4周时都可表达rhBMP2和rhVEGF。大动物骨缺损修复实验中，前2周内3组动物均未出现明显的急性炎症反应；连续X线观察和骨切片显示：A组在术后第3个月已完全修复，且修复效果和进程明显优于B组，C组缺损则主要由纤维结缔充填。结论  rhBMP2及rhVEGF转染ADSCs后可获得4周内稳定的表达。携带该缓释体系的新型组织工程骨是一种具有显著成骨能力的优良骨缺损修复材料。
      【关键词】重组人骨形成蛋白2；血管内皮生长因子；转染；转染脂肪源性干细胞；表达；组织工程骨；骨缺损；修复


　　Expression of rhBMP2 & rhVEGF gene in ADSCs and application those to bone defect repair
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　　YANG Zailiang,ZHANG Bo,ZHOU Jihong,et al.0 J% @) {! }% x3 p5 m$ {

　　（Department 4,State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China）

　　Abstract： Objective To observe the expression of rhBMP2 & VEGF gene that were transfected into adipose-derived stem cells （ADSCs） in vitro,and application of the tissueengineered bone with the transfected compound to repair the bone defect of ulna of Guizhou minipigs.Methods The ADSCs were transfected with rhBMP2& VEGF by LipofectamineTM2000 and selected by G418.The expression of rhBMP2 & VEGF gene in ADSCs was tested with immunohistochemistry and RTPCR in the 48h and 4th week after transfected.The minipigs were divided into 3 groups:the 1.5cm bone defect was made on the midpiece of ulna.In A group,the defect was repaired by ACBM with the ADSCs that transfected by rhBMP2 & VEGF;in B group,the defect was repaired by ACBM with the ADSCs only;in C group,no treatment for bone defect.The effects of repairwere evaluated by Xray and histological section.Results The rhBMP2 & VEGF gene could be expressed in 48h and 4th week after transfected.In all 3 groups there were no acute inflammatory reaction and focal necrosis in two weeks after operation.The Xray and histological evidence showed completely repair in A group,and their capacity of repairing bone defect were better than those of B group.In C group, bone defect were filled by fibrous tissue.Conclusion The rhBMP2 & VEGF gene in ADSCs have stable expression in four weeks after transfected.The tissueengineered bone that are constructed by ACBM and ADSCs with rhBMP2 & VEGF gene is a satisfactory and effective osteogenetic repair substitute for bone defect.
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　　Key words:rhBMP2；VEGF；transfect；ADSCs；expression；tissueengineered bone；bone defect；repair* J! F( O/ g, i! A" S1 M* }

　　近来脂肪源性干细胞（ADSCs）应用于骨组织工程，为骨折和骨缺损完全再生修复提供了更好的取材来源［1］。rhBMP2和rhVEGF能够有效地诱导刺激ADSCs成骨，但其作为半衰期短的生物小分子单独复合入组织工程骨中效果较差［2］。我们的前期研究表明，rhBMP2这类具有生物活性的小分子可以安全地转基因导入ADSCs ，而对ADSCs的生长增殖无明显影响。本研究旨在进一步对生物活性因子转染ADSCs后的表达情况及该转染缓释体系复合到组织工程骨中修复小香猪骨缺损的效果来进行考察，以期为该转染体系构建的骨组织工程可行性运用提供实验依据。7 j( g+ `6 N; T

　　材料与方法/ I/ u8 b& [/ x
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　　1 实验材料及动物九月龄贵州小香猪，雄性，体重20kg左右（第三军医大学大坪医院动物实验中心提供）。戊巴比妥钠、Ⅰ型胶原酶（Sigma）、胎牛血清（Hyclone）、DMEM/F12培养基、胰酶EDTA、PCDNA3rhBMP2表达质粒（香港大学林李家宓教授惠赠）、PCDNA3rhVEGF( 大坪医院六室惠赠),LipofectamineTM2000转染试剂（Invitrogen）、G418、RNA提取相关试剂、逆转录试剂盒（Takara）、SABC免疫试剂盒（中杉金桥）、rhBMP2一抗（Boster）、rhVEGF一抗（中杉金桥）、骨脱钙切片相关试剂。CO2细胞恒温培养箱、超净工作台、倒置显微镜、恒温细菌振荡培养箱、电泳仪、PCR仪、骨科手术器械、X线机、切片机。9 N" z/ _, ]! P' @

　　2 ADSCs的分离培养取9个月龄贵州小香猪腹壁皮下脂肪组织约10ml左右，生理盐水冲洗后剪碎，Ⅰ型胶原酶（0.75g/L），37℃消化60分钟左右呈黏糊状，加入等体积的DMEM/F12培养基中和，用50目的滤网过滤，滤液离心（10分钟,1000r/min）,弃上清，DMEM/F12培养基重悬，100目滤网过滤,离心，弃上清。最后，沉淀细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，调整细胞浓度为1105/ml，种植于25cm2培养瓶中，置37℃、5％CO2细胞培养箱中连续传代培养。
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　　3 PCDNA3rhBMP2、PCDNA3rhVEGF质粒基因转染ADSCs及G418筛选取已达90％融合的第四代ADSCs进行转染，步骤如下：（1）转染前30分钟在有细胞的六孔板中更换无血清无抗生素的DMEM/F12培养基；（2）把4μg的纯化PCDNA3rhBMP2、PCDNA3rhVEGF质粒及PCDNA3空质粒载体分别加入250μl无血清无抗生素培养基中，轻轻混匀；用250μl无血清无抗生素培养基稀释10μl转染试剂，室温下孵育5分钟；将上述两液合并混匀为质粒脂质体复合物，室温下孵育10~20分钟；（3）将500μl该复合物加入到含ADSCs的单孔培养基中，总体系在2ml左右，混匀；（4）4~6小时后更换等体积含10％胎牛血清正常DMEM/F12培养基。转染后48小时传代，待传代细胞生长达到80％融合后进行G418抗性筛选：（1）300μg/ml持续筛选1周左右；（2）150μg/ml维持筛选3~4天；（3）扩大培养1周。转染和G418筛选均同时设置未转染ADSCs为实验对照。
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　　4 转染后的表达鉴定转录水平表达：用TRIpure试剂（BioTeke）提取转染后第2天和第4周及对照组的细胞总RNA。将获得的总RNA逆转录后PCR扩增得到结果，具体实验步骤按照Promege公司的MMLV逆转录酶型RTPCR逆转录试剂盒说明进行。rhBMP2左侧引物序列为accatgaagaatctttggaagaac，右侧引物序列为tactagcaatggccttatctgtga；VEGF左侧引物序列为agtggtgaagttcatggatgtcta，右侧引物序列为tctgcaagtacgttcgtttaactc。蛋白质水平的表达：取转染后第2天和第4周已爬片及相应时相点对照组的细胞进行免疫组织化学染色法检测，具体方法同SABC试剂盒（中杉金桥）说明书。一抗为兔抗人BMP2和VEGF，二抗为SABC试剂盒中生物素化通用二抗。
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　　5 含转基因缓释体系的组织工程骨修复骨缺损
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　　5.1 含转基因缓释体系组织工程骨的制备将新鲜的猪肋骨去除软组织，制成1.5cm左右的骨块，在适宜的pH下经Dispase酶和TritonX100联合作用，然后再脱脂、脱蛋白等处理，而制成脱细胞骨基质（ACBM）。经钴60及使用前环氧乙烷消毒后备用。分别将转染rhBMP2和rhVEGF后48小时的ADSCs消化、离心，收集到细胞。把2种携带不同生长因子的细胞按1：1混合，含10% FCS的DMEM/F12 培养基调整细胞浓度达到2105个/ml，然后与预先准备好的ACBM在37％、5%CO2、饱和湿度下共培养72小时，PBS冲洗后即可用于骨缺损的修复［3］。5 S( V5 f. S* `: }2 A7 Z
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　　5.2 实验动物分组和骨缺损模型的制备共4只动物编为1~4号。实验分为3组：(A组)转染了生物活性因子的ADSCs与脱细胞骨基质材料（ACBM）复合而成新型组织工程骨植入修复组，选用1~4号动物的右前肢；（B组）未转染生物活性因子的ADSCs复合ACBM植入修复组，选用1~2号动物的左前肢；（C组）单纯的骨缺损未处理组，选用3~4号动物的左前肢。动物截取尺骨中段骨，造成尺骨中段1.5cm大小的完全贯通型骨缺损。常规饲养，注意保温，自由活动。术后3日连续肌注青霉素钠80万U/天。

　　5.3 观察指标及方法 X线观察：术后第1、2、4周、第2、3个月，动物麻醉后拍摄尺骨侧位片，观察成骨情况。大体及病理切片观察：术后动物手术肢体的炎症反应情况、活动情况及恢复的大体情况；术后第4周处死第1号和第3号动物，第3个月处死第2号和第4号动物，取骨缺损两侧及中部组织以10％多聚甲醛固定，再以10％硝酸脱钙后石蜡包埋切片观察成骨的情况。( }* r, S% N2 }1 i) a7 W

　　结果
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　　1 G418筛选结果在转染后2周即G418筛选12天左右形成阳性克隆，对照组组细胞则在转染后8~10天即筛选后1周左右全部死亡。挑取抗性克隆扩大培养到转染后4周，获得RT-PCR和免疫组化所需的细胞数。5 a$ t& P. F. \( M- C

　　2 rhBMP2和rhVEGF基因在猪ADSCs中的转录PCDNA3rhBMP2质粒转染贵州小香猪ADSCs后第2天和第4周提取的总RNA，经RT-PCR扩增得到了450bp左右的条带，与rhBMP-2酶切图谱中大小一致［4］，而PCDNA3空质粒载体转染对照组2个时相点均没有rhBMP-2基因转录水平的表达（图1）。PCDNA3rhVEGF转染后48小时和第4周提取总RNA，RT-PCR扩增结果为430bp的条带，与陈伟等报道的一致［5］。2 k( s! C! q4 f! u: A8 O2 `
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　　3 免疫组化对rhBMP-2和VEGF基因在蛋白质水平表达的检测用免疫组化SABC法分别对转染rhBMP2基因后第2天和第4周细胞进行检测，转染第2天的部分细胞胞浆内可见棕褐色颗粒，而转染第4周的大部分细胞胞浆内有棕褐色染色的颗粒，但空白载体对照组第2天和第4周表达为阴性。转VEGF基因ADSCs在第2天和第4周的SABC免疫组化结果显示细胞胞浆内有棕褐色阳性表达信号（图2）。+ Q& ~. _' O1 r

　　4 骨缺损模型修复后观察结果
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　　4.1 X线观察结果三组动物第1周X线片上没有骨的明显移位；修复组植入骨在位，对照组骨缺损存在；均未有明显成骨及骨新生。A组第2周已开始有新生骨痂生成，第1~2个月骨痂生成明显，第3个月时修复处断端骨皮质生长接近连续、骨髓腔已再通（图3）；B组1个月后才有一定骨痂生成，第3个月时有一较薄的连续骨痂生成，新生的骨髓腔未通，正在由缺损两端向中部靠近。C组在1个月后缺损断端两侧有一些骨痂生成，但3个月后缺损明显存在，不能自行愈合。

　　4.2 大体观察结果术后2周内3组动物均未出现明显的感染。4周时：A组动物整个组织工程骨植入修复处都有新骨生成，但尚不是连续完全修复，植入的ACBM部分吸收；B组动物新骨由缺损两端开始长入，形成量不多；C组动物骨缺损两端有一些少量的新骨生长，但附近肉芽组织开始长入并充填缺损空位。第3个月时：A组有连续骨皮质生成，对位对线良好；B组有大量新生骨由两端长入，仍可见未降解的机化ACBM；C组新骨生成量不多，缺损中有大量机化的肉芽结缔组织。

　　4.3 脱钙骨切片结果术后第4周：A组，仍有一定量的淋巴细胞和浆细胞浸润；整个修复处软骨细胞和成骨细胞大量生长活跃，分泌较多骨基质；其中部分已向成熟的骨细胞转化，并开始有骨小梁形成（图4）。B组，也有淋巴细胞和浆细胞浸润；以肥大增生的软骨细胞为主，成骨细胞和骨基质及较少，骨小梁幼稚，且主要集中在缺损两端；ACBM有少量降解。C组，炎细胞浸润较少；修复组织以肉芽组织为主。术后第3个月：A组，炎细胞较少见；大量的新骨生成，骨小梁成型，骨细胞排列有序，骨髓腔和哈佛氏管形成。B组，有炎细胞浸润；仍可见部分肥大的软骨基质；两端处大量骨细胞生成，骨小梁开始成熟，部分区域有骨髓腔形成。C组，靠近宿主骨附近有一些软骨组织和骨组织生成，其余大部分为机化的纤维结缔充填。( z/ ^1 g2 U' ?5 ^# `
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　　a.PCDNA3rhBMP2转染后48小时;b.PCDNA3rhBMP2转染后4周；c.PCDNA3空质粒转染后48小时；d.PCDNA3空质粒转染后4周6 q8 S7 E1 K9 N
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　　图1 质粒PCDNA3rhBMP2转染ADSCs后RTPCR电泳结果（略）
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　　图2 转染后第4周rhVEGF在ADSCs中的表达(SABC法100)（略）

　　a:1周; b:2周; c:4周; d:12周" n5 n. \2 e; G9 Q/ I: z5 ~

　　图3 A组动物X线片（略）

　　图4 A组第4周脱钙骨组织切片（HE 100）（略）
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　　讨论) l3 W3 F* D6 m; I

　　骨缺损的修复作为一大难题，长久以来一直困扰着骨科医生。目前广泛采用的自体骨移植、同种异体骨移植和异体骨移植等因来源有限，易引发供骨区并发症、移植后免疫反应及疾病传播等问题，而不能更好的满足临床修复的需要。随着人工骨材料的迅速发展，其中以采用基因工程和组织工程技术相结合，把外源性生长因子基因转染到种子细胞中，组成一个相互作用的转染复合体系，用来构建组织工程骨进行体内修复的方法得到了极大关注和肯定。来自中胚层可诱导成骨的间充质细胞群ADSCs，以来源广泛易大量获得而被作为潜在的理想种子细胞［6］。在前期对ADSCs研究中表明，ADSCs作为宿主细胞转染外源性生长因子基因后未发生畸变及生长增殖的明显改变，可以作为携带了目的基因的种子细胞安全地应用于再生医学研究。生长因子中rhBMP2是唯一能够单独诱导骨组织形成的生长因子［7］，在适宜的局部微环境下能异位诱导骨生成［8］；rhVEGF则通过诱导血管新生从而间接诱导成骨［9］，它们在维持ADSCs向骨分化的整个全过程中发挥不可或缺的作用。但考虑到它们是生物小分子半衰期短，在单独加入种植有ADSCs的支架材料回植入体内后，很快就会被扩散稀释或酶解吸收的特点，希望通过转基因的方式让它们在ADSCs中缓释的表达，以便在修复最关键的前4周中有效发挥诱导成骨的作用。把质粒PCDNA3rhBMP2和PCDNA3VEGF通过脂质体介导的方式转染ADSCs,然后提取宿主细胞的总RNA进行逆转录后扩增得到了二者的基因条带，表明二者的基因可以稳定的整合到宿主细胞中而且还保留了自己的基因型。同时，以免疫组化检测到转染后ADSCs上48小时和第4周都有rhBMP2和rhVEGF的表达，在蛋白质水平也证实了二者能够在转染后有及时而稳定的表达。将转染有rhBMP2和VEGF基因的ADSCs复合入骨组织工程基质材料ACBM中构建成了新型的组织工程骨，植入大动物承重骨骨缺损中验证其修复效果。选择贵州小香猪前肢尺骨中段制备1.5cm大小的骨缺损模型。猪从同源性的角度来说与人较接近便于进一步的研究；前肢尺骨为承重骨，且尺桡骨骨间膜结合牢靠，单纯的尺骨缺损不会造成骨的不稳定，修复后不需要特别的固定支持；同时有文献报道大型哺乳动物负重骨＞1.5cm骨缺损不能通过自体修复而完全愈合［10］，因此猪是理想的实验动物模型。骨植入后愈合的机制分为骨诱导、骨传导和自体成骨3种［11］。实验中复合有rhBMP2和rhVEGF的组织工程骨植入修复骨缺损的观察结果表明：因为是异种骨植入早期仍有一定的免疫排斥反应对自体成骨细胞的破坏，自体成骨能力差；其修复是以全骨诱导新生为主骨传导为辅，且成骨效果明显，1个月有一定量的成熟骨小梁形成，3个月时缺损处新骨形成骨髓腔再通基本修复完成。而单纯ADSCs和ACBM复合物植入骨缺损则主要是以两端向中央传导修复为主，诱导成骨效果不是很明显，缺损在第3个月时只是部分修复。骨缺损未处理组，早期因为免疫排斥反应小，可有一定自身成骨，但缺损不能完全愈合，大部分将被纤维结缔组织充填。以上实验结果提示：携带了成骨效应生物活性因子的ADSCs具有生物安全性、表达稳定性及成骨有效性，以其构建的组织工程骨运用于骨缺损修复得到了良好的愈合效果。但具体操作中我们面临了脂质体转染效率不够高、转染产物获得较少这一制约临床大量应用的问题。新型的慢病毒转染系统以其高效的转染率和稳定的表达性能而将成为下一步研究的重点。
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