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作者：张钦，马真胜，刘建，孟国林，张堃，李毅，张志敏作者单位：第四军医大学西京医院骨科，陕西 西安 710033 & ]0 q# f: s7 L+ g8 ~
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【摘要】 目的: 探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞在修复兔颅骨缺损中的应用前景. 方法: 提取兔脂肪源性干细胞，成骨诱导并检测，将成骨诱导前后的脂肪源性干细胞种植到自制松质骨支架上，将细胞支架复合物和单纯支架材料分别移植至兔颅骨缺损部位. 结果: 与未诱导的脂肪源性干细胞复合支架、单纯支架以及空白处理对比，成骨诱导后的脂肪源性干细胞复合支架修复骨缺损面积最大，差异具有统计学意义（P
' A- H6 W$ [' h. D0 C. [! u 【关键词】脂肪源性干细胞；异种松质骨；支架材料；骨代用品；生物医学工程；成骨诱导；种子细胞4 M0 L. Q0 U) {+ O4 F1 c
0引言4 z* X2 C* h: k5 z7 j6 b: W; W
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如何获得充足的种子细胞是长期以来限制组织工程研究的瓶颈，骨髓基质干细胞尽管已被广泛应用于组织工程研究，但由于其干细胞含量过低、骨髓抽取量有限以及对患者造成的创伤等，使其广泛应用到受限. 2001年Zuk等［1］从脂肪组织中成功提取了干细胞，并成功诱导其向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化. 我们将成骨诱导的脂肪源性干细胞（adiposederived stem cells，ADSCs）与异种松质骨支架复合，移植至兔颅骨缺损部位，以探讨成骨诱导脂肪源性干细胞修复骨缺损的应用前景.% n- U6 H! N9 `/ w1 f z
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1材料和方法
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- Y, F( v, [8 a- t$ I1.1材料新西兰大白兔12只，4 mo龄，体质量2.0～2.2 kg（第四军医大学实验动物中心）；Dolbecco改良的Eagle培养基（DMEM），胎牛血清（FBS），地塞米松，抗坏血酸，β甘油磷酸钠（美国Sigma公司）；碱性磷酸酶（ALP）活性测定试剂盒（南京建成生物技术有限公司），牛股骨，甲醇，氯仿，300 g/L H2O2等（市售）.$ i, _1 t4 D& B0 _( _% T% v- Z
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1.2方法2 e3 |6 w6 x( Y
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1.2.1ADSCs的分离培养［1］将新西兰大白兔按0.2 mL/kg速眠新麻醉，取颈部后正中3 cm切口，无菌切取肩胛上脂肪组织约2 mL. 清除切取组织中肉眼可见的小血管，去除外包膜和明显的结缔组织，DHanks冲洗3遍以洗去红细胞的污染. 切碎成糊状，加入2 g/LⅠ型胶原酶5 mL，在37℃水浴搅拌消化40 min，过滤，加入两倍体积DMEM培养液（含100 mL/L FBS, 1105U/L青霉素, 1105 U/L链霉素)，1000 r/min，离心10 min，倾去上层脂肪及上清，基础培养基重悬细胞, 接种至25 cm2培养瓶内, 种植密度1.5104/cm2. 在37℃培养箱内培养,3 d后换液，观察原代细胞的生长. 细胞融合达90%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代.0 W* C9 t Z* ` G" o
0 c( C$ t2 Y1 V, p) H7 X, z1.2.2ADSCs的成骨诱导在第1次换液时将部分细胞改为成骨诱导培养液(基础培养液加10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β甘油磷酸钠，50 mg/L抗坏血酸［1］)培养. 细胞融合达90%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代.
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8 f, S$ E' ^8 ?, G/ @) l1.2.3ALP活性测定将第2代ADSCs以5103/孔的密度接种于96孔板中,成骨诱导培养液诱导0，3，6，9，12，15 d后,PBS漂洗,加入50 μL细胞裂解液4℃过夜, ALP活性测定试剂盒检测ALP活性.
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1.2.4茜素红染色取成骨诱导1 wk的细胞爬片培养1 wk,PBS冲洗3遍，950 mL/L乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗3次，1 g/L茜素红于37℃染色30 min，蒸馏水冲洗，干燥，封片.- ?/ l' B. @4 r3 n
- X. A! u1 k) R! d0 q1.2.5松质骨支架的制备取市售牛股骨，将股骨头松质骨加工成直径10 mm，厚2 mm的骨片. 将骨片置入1∶1的甲醇∶氯仿100 mL中脱脂24 h，12 h换液1次，蒸馏水冲洗. 将脱脂后的骨片置入300 mL/L H2O2 100 mL中脱蛋白48 h，每12 h换液1次. 蒸馏水冲洗. 将脱脂、脱蛋白后的骨片置入0.6 mol/L的HCL中脱钙5 min，蒸馏水冲洗. 将脱脂、脱蛋白、脱钙后的松质骨片低温晾干，密封包装，Co60灭菌备用. 种植细胞前将成品松质骨无菌条件下PBS液中浸泡7 d，分别在基础培养液和诱导培养液中浸泡3 d.
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! s) L, q) C! L r' Y7 A! t/ z1.2.6细胞的种植及检测将ADSCs和成骨诱导15 d的ADSCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化，离心，分别用基础培养液和诱导培养液悬浮,调整细胞密度至11010/L. 将基础培养液和诱导培养液中浸泡的松质骨支架转移至24孔培养板中，分别种植上述细胞悬浮液100 μL，置37℃培养箱内6 h使细胞贴壁，然后分别加入基础培养液及诱导培养液培养. 将复合后培养5 d的细胞支架复合物固定，干燥，喷金，扫描电镜观察. 复合培养7 d后手术植入颅骨缺损部位.1 f5 L' v; W) r% Q O8 Y
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1.2.7动物分组及处理将12只大白兔按0.2 mL/kg速眠新麻醉，取双侧颅骨直径10 mm钻孔，24孔分为4组，每组6孔. ① 支架 成骨诱导ADSCs（A组）；② 支架 ADSCs（B组）；③ 单纯支架（C组）；④ 对照组（D组）. A，B组植入上述成骨诱导和未诱导的脂肪源性干细胞复合异种松质骨支架，所用细胞均为自体细胞；C组植入单纯的松质骨支架，为前述松质骨成品PBS液中浸泡7 d，9 g/L NaCl溶液中浸泡3 d后植入；D组不做处理. 术前术后肌注庆大霉素，2万U/kg. 术后14 wk用过量戊巴比妥钠麻醉处死动物，取材，X线摄片，计算成骨面积，HE染色行组织学分析.+ f- L3 z% h2 ?" ^6 n
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统计学处理：数据以x±s表示,应用SPSS医用统计软件包进行OneWay ANOVA检验. P9 O& l& }& v& ^1 U7 X) {. v
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2.1细胞培养原代脂肪源性干细胞呈梭形，在β甘油磷酸钠，地塞米松，抗坏血酸的诱导下，能向成骨方向分化（图 1A）. 诱导2 wk后茜素红染色阳性，提示有钙结节形成(图1B). ALP活性检测结果显示，成骨诱导6 d后，支架 成骨诱导ADSCs组与对照组间差异具有统计学意义（P
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9 h4 ?, o: k0 x, e( |* a2.2电镜观察电镜观察结果显示，成品松质骨表面粗糙凸凹不平，ADSCs及成骨诱导后的ADSCs均能粘附在其表面并伸入裂隙中生长，呈现梭形，表面有突起伪足（图2）.
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2.3术后大体观察手术植入后大体观察，家兔手术区域无红肿、渗出，无异物排出，给予抗感染治疗，家兔饮食、活动良好.
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5 I4 p- M, K3 x8 v3 }2.4定量分析术后14 wk取材，X线摄片显示缺损部位有不同量的骨组织形成. 对照组、单纯支架组和支架 ADSCs组骨缺损部位成骨面积差异无统计学意义（P>0.05）. 支架 成骨诱导ADSCs组的成骨面积大于其余3组，差异具有统计学意义（P
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2.5组织学分析HE染色可见各组均有不同程度的新骨形成，尤以支架 成骨诱导ADSCs组新骨形成最为显著. 支架 成骨诱导ADSCs组，支架 ADSCs组和单纯支架组均可见支架材料不同程度被吸收，沿支架有新骨形成，支架吸收、新骨形成均以支架 成骨诱导ADSCs组最为显著（图3）.& h W5 W& t$ r7 ~% w* i
1 |( f# S: K5 a! Z3 c8 c6 F+ i 3讨论
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7 w: N0 Q3 H5 K* f. n: C3 ZADSCs是一种新的干细胞，能够向骨、软骨、心肌细胞等多个方向分化［1］. ADSCs可经抽脂术获得，安全性较高，不良反应少，患者容易接受， ASCs在体外增殖和诱导时对血清的要求较低［2-5］./ z9 J, x1 D7 {& ~ `+ F& g
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在抗坏血酸、地塞米松、β磷酸甘油钠的诱导下，ADSCs的ALP的表达增多，诱导2 wk后，茜素红染色阳性，提示有钙结节的形成，而非诱导组茜素红染色为阴性，提示ADSCs向成骨方向的分化. 2003年Lee 等［6］将ADSCs应用于体内成骨研究，将成骨诱导后的ADSCs复合多孔PLA材料埋植于大鼠皮下，8 wk后有骨组织生成. 将成骨诱导的ADSCs与可吸收材料相复合，有望用于修复骨缺损. Alejandro等［3］将成骨诱导后的ADSCs用于修复大鼠腭骨缺损，12 wk后，在缺损部位发现了新生的骨组织. Stefan等［7］将ADSCs与自体松质骨颗粒和纤维蛋白胶相混合，成功用于修复一7岁女孩大面积颅骨缺损，尽管还不能确定这其中ADSCs起了多大的作用，但这一临床病例确实令关注ADSCs的人们大受鼓舞.
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异种骨来源广泛，没有传播疾病的潜在危险性，且因骨组织结构在不同种属动物间存在高度同源性，其骨小梁、小梁间隙、空隙率、骨内管腔系统及骨盐支架的三维结构有利于组织细胞粘附、生长，并为细胞外基质的分泌提供宽大的内部空间及表面积，加之其无机成分主要是羟基磷灰石， 与人骨成分相同， 因此，异种骨结构植入体内后易被宿主组织细胞接近而发生爬行替代及生物降解，应当是较理想的载体材料［8-10］.
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我们将自制脱钙、去抗原后的异种松质骨用于骨组织工程的支架材料，将其与ADSCs相复合，用于修复骨缺损. 结果表明，脱钙、去抗原后的异种松质骨具有良好的生物相容性，成骨诱导前后的ADSCs均能在其表面良好生长，植入体内后，能够被逐步吸收. 脱钙、去抗原后的异种松质骨可用作骨组织工程的支架.
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我们所用细胞为自体细胞，最大程度减小了因机体免疫力的不同而对试验结果造成的影响. 植入体内12 wk后，取材X线摄片结果显示，成骨诱导后的ADSCs复合异种松质骨支架后能够更好地修复骨缺损，而未诱导的支架 ADSCs、单纯支架、对照组3组间差异无统计学意义. HE染色结果显示支架 成骨诱导ADSCs组，支架 ADSCs组和单纯支架组均可见支架材料不同程度被吸收，沿支架有新骨形成，支架吸收、新骨形成，但均以支架 成骨诱导ADSCs组最为显著. 成骨诱导后的ADSCs促进了骨缺损的修复.! h' K( e( c8 ]4 p
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