|
  
- 积分
- 8
- 威望
- 8
- 包包
- 898
|
作者：徐鸿绪 刘雅峰 谭恩勋 蔡建涛作者单位：中山大学附属第一医院器官移植实验室, 1血液内科, 广州 510080；2广东省人民医院血液内科，广州 510080
2 J* r7 h/ \! [- K2 E
3 v: T& D3 `+ N3 x! I% r0 a* | a
# i3 Z: R, H1 [, \& k6 L6 F
+ n7 A- E- h+ D9 |+ p; u8 C: A
! G! b$ a' Z; i, I' E# a: O% O- m/ g
9 |) e9 }6 n5 p2 F- W4 u/ ^( D f
1 f1 k" f; B* `" a* P8 I 4 I3 F5 l/ y( [# ~* a( V
, z. j9 D1 S7 L9 S# _. V
- G% x# D8 ^/ E, M, J" N7 b 7 {/ |$ e! f8 a( A8 a8 E" y5 C1 R/ k: C
3 _8 V. O* |% }! B4 z5 g: v
【摘要】 本研究探讨基于核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence based amplification，NASBA)检测mRNA对异基因外周血干细胞移植受者术后人类巨细胞病毒(HCMV)感染的诊断价值，并评价该技术对抗病毒治疗的指导意义。以128例移植术后患者为研究对象,采集移植术后外周血352份;利用NASBA检测外周血中HCMV基质外壳蛋白PP67（UL65）mRNA,并与HCMV DNA的结果进行比较。结果表明：352份血标本中，HCMV mRNA阳性105份（29.83%），HCMV DNA阳性183份（51.99%）。128例患者术后有45例发展为HCMV病， HCMV DNA和HCMV mRNA检测诊断HCMV病的敏感性和特异性分别为95.56%(43/45)、93.33%(42/45)和60.24%(50/83)、97.59%(81/83)。两者特异性的比较差异具有显著性（P＜0.05）。结论：HCMV-PP67的NASBA检测方法具有快速、敏感性高和特异性强等优点，可作为快速检测HCMV病的方法用于临床。该法检测结果与移植受者的临床症状相关，故也可用作监视异基因造血干细胞移植受者术后HCMV感染和指导抗病毒治疗的依据。
: p6 C, t$ b1 t8 [8 u2 A 【关键词】异基因外周血干细胞移植 人类巨细胞病毒感染 基于核酸序列的扩增技术
# i% L1 q" ~4 x4 B Application of Nucleic Acid Sequence-Based Amplification in Detection of Cytomegalovirus mRNA of Recipients after Allogeneic Peripheral Blood Stem Cell Transplantation5 ]) s( J- j7 G8 V3 `/ b ?. K
. {% x) m! I# n5 s$ r2 Z% B$ {6 g7 Q$ a XU Hong-Xu, LIU Ya-Feng1，TAN En-Xun1, CAI Jian-Tao2% l$ o. f3 v' b3 i
' o. j# X5 a( y" K# pLaboratory of Transplantation Surgery, 1Department ofHematologic Internal Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080,China; 2Department of Hematologic Internal Medicine, People Hospital of Guangdong Province, Guangzhou, 510080,China
0 `; N% b1 A* w) n4 Y9 c( |( n) v5 f# S/ ? {' J8 A: w' c
AbstractThe study was purposed to investigate diagnostic value of late-mRNA detection by nucleic acid sequence-based amplification ( NASBA) technique for human cytomegalovirus (HCMV)infection of the recipients after allo-geneic peripheral blood stem cell transplantation (allo-PBSCT) and to evaluate the clinical significance for guiding antiviral therapy. 352 samples were collected from 128 transplant patients after allo-PBSCT. A molecular biological diagnostic technique-NASBA was used to detect human cytomegalovirus (HCMV) late mRNA encoding the viral structural protein PP67 (UL65) expression in peripheral blood of recipients after allo-PBSCT, and the detected results were compared with HCMV DNA detection by PCR.The sensitivity, specificity and early diagnostic value of HCMV mRNA detection for HCMV disease were evaluated.The results showed that out of352 detectedblood specimens from 84 patients183 specimens （51.99%）were positive of HCMV DNA by PCR, 105specimens (29.83 %) were positive of HCMV mRNA by NASBA. 45 patients were infected byHCMV. The sensitivity and specificity of HCMV DNA and HCMV mRNA for detecting HCMV disease were 95.56% (43/45),93.33% (42/45) and 60.24% (50/83),97.59% (81/83). The results of specificity showed significant difference between two groups of HCMV mRNA and HCMV DNA（P＜0.05）. It isconcluded that the detection oflate-mRNA of HCMV by NASBAtechnique israpid, sensitive and specific detection for HCMV active infection. The detected result correlates with clinical symptoms. It can monitor HCMV infection of allo-PBSCT transplanted recipients and provide indication to antiviral therapy.
% k. c8 c1 J; W% {& C- K1 n0 _5 ~3 {/ y/ {. V1 d
Key wordsallogeneic peripheral blood stem cell transplantation； human cytomegalovirus infection;nucleic acid sequence-based amplification
3 Y' d: f& h; t/ w* J4 X( \
# a/ Q5 @: y. d D* R 异基因外周血干细胞移植（allogeneic peripheral blood stem cell transplant, allo-PBSCT）是近年来治疗人类恶性血液病、某些遗传性疾病的一种有效方法。 人类巨细胞病毒 (human cytomegalovirus, HCMV)感染是异基因造血干细胞移植术后最常见的病毒感染，与急性移植物抗宿主病、原发病复发一起被公认为allo-PBSCT 后死亡的三大主要原因，已日益为临床医生所重视［1］。因而如何早期、快速而精确的诊断HCMV活动性感染已成为allo-PBSCT术后监测HCMV感染状况、及时给予抗病毒治疗以及判断预后的关键。mRNA作为病毒基因转录的产物和复制活跃的标志，是活动性感染的指标［2］。本研究采用基于核酸序列的扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification, NASBA）检测HCMV基质外壳蛋白PP67（UL65）的mRNA，并探讨HCMV-PP67检测在HCMV活动性感染诊断中的意义。: _& E3 k, p7 D( |1 J; m
! e K- q: }. ?
材料和方法
7 O8 k5 E1 l" u# M
4 l6 P0 g; k* z 病例资料和标本
6 Z+ t& p; G7 x- u0 r3 u! f: B+ w7 {' }% ^" K
广州地区异基因外周血干细胞移植的患者128例，男56例，女72例；年龄范围6-43岁，平均年龄为26岁。在上述128例患者中慢性髓性白血病(CML)25例,急性髓性白血病(AML)22例,急性淋巴细胞白血病(ALL)34例,骨髓增生异常综合征(MDS)4例,非霍奇金淋巴瘤(NHL)6例,再生障碍性贫血(AA)9例,β重型地中海贫血28例。采集移植术后外周血EDTA Na2抗凝，每份标本2 ml，连续收取，平均每人收取3份标本(2-5份不等)，对重复采血者间隔时间为2周,总计352份。另外,随机选取门诊体检的正常健康成年人(抗HCMV-IgM和HCMV-IgG阴性)20例作为正常对照,男女各10例，年龄19-48岁。HCMV AD169株病毒感染的人胚肺成纤维细胞(中山大学基础医学院微生物学教研室惠赠)上清液作为阳性对照。
) j5 q; U: d2 y. l4 P9 A% S ?! _& S. U6 [- Q m* h. Q
仪器和主要试剂, C5 j6 r1 K' a
: Z+ n8 I& p; Y6 q Nuclisens NASBA Reader由生物梅里埃公司提供。HCMV-DNA PCR检测试剂盒由华美生物工程公司提供；HCMVPP67-mRNA检测试剂盒购自法国生物梅里埃公司。引物1: 5′-AATTCTAATACGACT CACTATAGGGAGAGGGTCGATTCAGACTGA-3′；引物2: 5′-CTGGAGATATATGTTGACCA-3′；WT RNA的ECL探针：5′-CCAAAAAGCTAGCCGTCA CG-3′； SCRNA的ECL探针：5′-GAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGG-3′。# y3 _; O" Y5 x: M6 E1 ^ h
1 N% x7 I! }/ U2 t0 ^ HCMV病临床诊断标准［3，4］
" U- M& I+ \' k3 v7 i! a, D6 [3 C9 \! a0 U: `
临床表现：①发热，体温≥38℃，持续3天以上；②无痰性咳嗽、胸闷、紫绀或呼吸困难、唇面发绀及低氧血症(氧饱和度
& {( q% z+ I5 Q }5 d& o) A: R; R
实验方法1 ?4 i& O" M4 u3 L% B' ^& B$ ~5 y
5 S6 s4 K. e7 h$ x, s0 Y- L& K
病毒核酸的提取吸取100 μl全血加入到装有0.9 ml lysis buffer的离心管中，旋涡振荡混匀。加入system control (SC)RNA 20 μl,振荡；10 000g离心30秒，加入50μl活化的silica悬液（0.4gsilica悬浮于1 ml 的 0.1 NH4Cl溶液），随后室温（15℃-30℃）放置10分钟，每隔2分钟振荡1次。最后10 000g离心30秒；核酸被吸附在活化的silica微粒上沉于管底，吸弃上清液，然后分别用GuSCN洗涤缓冲液（5 mmol/L 硫酸氰胍、50 mmol/L Tris-HCl, pH 6.4），70%乙醇和丙酮各1 ml洗涤沉淀1次；最后，将离心管置于56℃恒温加热块中干燥10分钟，加入50 μl的洗脱缓冲液（1.0 mmol/L Tris缓冲液,pH 8.5) 后，再放回加热块保温10分钟，每5分钟取出振荡混匀；10 000g离心2分钟，各吸取上清液5 μl作为反应模板，其余冻存于-70℃备用。
6 M6 H; n$ t' V) Y" @6 q" A
3 B& j' {7 _1 K4 n, X HCMV DNA的PCR检测以上述提取的上清液作为模板，PCR扩增操作及结果判断均严格按说明书进行，扩增片段为430 bp。
7 X# Y1 d# F$ T: h" K% u6 J( m* L: N' K& `; r# F6 [. l
HCMV PP67 mRNA扩增检测分别用引物稀释液（40 mmol/L Tris-HCl, pH 7.2，15%二甲亚砜）和酶稀释液溶解稀释冻干的引物混合物（二硫苏糖醇、三磷酸脱氧核苷、ATP、CTP、UTP、GTP和ITP，引物1和引物2）和酶混合物（AMV逆转录酶、RNase H、T7 RNA聚合酶、牛血清白蛋白）；吸取10 μl引物混合物加入到1.5 mlEppendorf管中，加入5 μl核酸提取上清液，置65℃恒温加热块保温5分钟后，转到41℃恒温加热块再保温5分钟。吸取5 μl酶混合物加进反应管，然后用手指尖轻弹管底混匀，尽快放回41℃的加热块中，并至少保温5分钟以上，最后转到41℃的水浴箱中孵育90分钟。然后各取2支干净的5 ml试管作为WT（wild type）和SC （system control）杂交管。分别吸取20 μlWT杂交液和SC杂交液于各自杂交管中。用检测缓冲液等倍稀释5 μl扩增产物。然后每份标本各吸取5μl稀释扩增产物于WT管和SC管，振荡混匀，在41℃温水中杂交反应30分钟（每10分钟振荡混匀1次）。然后分别加入300 μl分析测试液于各杂交管。另取2支5ml管，1支以作为检测缓冲液代替扩增产物与WT杂交液进行反应作为阴性对照，另1支吸取250 μl本底溶液用于测试Nuclisens Reader 的本底。按编号和实验格局将各杂交管放置于Nuclisens ECL Reader转盘的相应位置，运行相关程序，读出实验结果。. W3 f: t( Q# M6 g/ Z
) P' Q3 |5 o4 {. Z HCMV病的治疗
. e( [; v* H6 `6 [. r6 ]: A. r1 ?! B
全部病例均按5 mg/(kg·d）分2次静脉滴注更昔洛韦2-4周, 至症状消失或体温正常后1周停药。疗程结束治疗无效者同时或改用磷甲酸钠90 mg/（kg·d），分两次进行静脉滴注，连续用药2-3周。HCMV相关性间质性肺炎(HCMV-IP)治疗：除上述抗HCMV药物外，丙种球蛋白5 g静脉点滴，隔日1次。3周后，抗HCMV药物减半量，再连续用8-10周。 严重者使用呼吸机并将免疫抑制剂用量减半，其它辅助治疗包括高频吸氧、白蛋白及解热药等综合措施。1 Z$ ~2 v, n! b* `* J- l7 m
0 j- n' W, |! r! Q# ]. [& s 结果
I( t2 q; ]! G$ I6 b8 O, j
- N, I. M; D$ r 正常对照检验结果2 I, \: \6 P5 @/ A
. s, P, k( N: O$ ^$ B7 `: g
20例正常健康成年人(抗HCMV血清检查阴性)的HCMV DNA和HCMV mRNA检验结果均为阴性。HCMV AD169株病毒感染的人胚肺成纤维细胞上清液经检测HCMV DNA和HCMV mRNA检验结果均为阳性。
' I* H0 K0 H# G9 }" O
^% G# u/ Y+ x, v( M% n 检测结果与临床的关系
y: f2 \( L4 O" m) p+ Z* `* A! T" ?# L, c- U2 Z
128例移植受者术后352份血标本，同时用PCR和 NASBA检测HCMV DNA和HCMV mRNA。结果表明，HCMV DNA阳性结果183份，阳性检出率51.99%(183/352)；HCMV mRNA阳性者为105份，阳性率29.83％（105/352）。128例移植受者中，根据临床表现出持续发热、无痰性干咳以及低血氧症等症状，结合生化检测及肺X光片结果，拟诊为HCMV感染的HCMV病患者45例。128例移植受者术后HCMV检测结果见附表。HCMV DNA和HCMV mRNA检测诊断HCMV病的敏感性和特异性分别为95.56%(43/45)、93.33%(42/45)和60.24%(50/83)、97.59%(81/83)。另外33例HCMV DNA 阳性患者没有表现出HCMV感染的临床症状,另有3例HCMV mRNA阴性和2例HCMV DNA阴性的患者出现HCMV感染的临床症状而被诊断为HCMV病；HCMV DNA和HCMV mRNA结果阳性对HCMV病的预测准确率分别为56.58%(43/76)和95.45%(42/44)。两种方法对HCMV病的评价指标比较，特异性和阳性预测值的差异在统计学上具有显著性（P0.05）。. N8 ~- D. z t' z n. b2 V, |
8 y$ d5 Q" c+ _( p) ~) |2 vTable 1. Results of HCMVdetected in 128 patients after allogeneic peripheral blood stem cell transplantationbyPCR andNASBA（略）
! s& m: A- ?! v& @" c0 D; c$ z& k- x t+ [# u
HCMV DNA.2 n& m ~2 c9 a$ d
/ ^/ v, Q+ @6 V4 n5 {3 E3 E HCMV DNA和HCMV mRNA阳性结果出现时间与HCMV感染的关系& c5 `% j( `( S/ j R/ `$ l
; `9 X# Z6 _: ~8 l45例HCMV病患者中,26例NASBA检测HCMV mRNA呈阳性的时间平均为临床症状出现前5天（临床症状出现前8天- 临床症状出现后15天），HCMV DNA检测呈阳性平均时间为临床症状出现前3天（临床症状出现前10天- 临床症状出现后19天）；HCMV mRNA和HCMV DNA两者同时阳性有12例。两者比较在统计学上没有显著性差异。
! M& y" H. L9 }4 d0 M1 A F* l$ V3 J3 J7 v' X$ E4 a# a/ p; o* U
HCMV DNA和HCMV mRNA在监测抗病毒药物疗效中的作用
Z" b2 \: W2 T W# N7 H: X3 i- h9 N( n! r6 \- ^
45例HCMV病患者均进行抗病毒治疗,其中23 例(51.1%)患者的HCMV mRNA在治疗疗程结束时检测呈阴性。7例无效者,其HCMV mRNA在治疗过程中始终呈阳性,均死于严重的肺部感染，另有15例死于原发病或其相关并发症。这说明HCMV mRNA的检测结果与更昔洛韦的抗病毒疗效之间具有良好的相关性,可用于监测更昔洛韦的治疗效果,指导抗HCMV治疗。用PCR法仅有10例(22%)的检测结果与更昔洛韦抗病毒疗效之间的具有相关性。
; x0 |; C# Z7 \2 U
% | U% v+ a: n 讨论
9 \/ t3 _+ D8 ^, `& D( |- A$ D8 V) n6 q- P+ O# }9 e
人类巨细胞病毒在人群中的感染相当普遍，正常人原发感染该病毒后常无临床表现。当机体免疫受抑制或免疫缺陷时，引起感染复发或反复排毒，特别是allo-HSCT患者由于术前进行过大剂量的化疗以及术后移植物抗宿主病的预防和治疗中使用了免疫抑制剂，容易发生严重的免疫抑制，导致术后HCMV活动性感染，如不及时诊治，常可引起致命危险和移植失败［5］。受体移植后HCMV感染率为70%-80%，且有10%-50%发展成间质性肺炎，其中大约60%-80%死亡。 如能早期诊断活动性HCMV感染，并及时给予抗病毒治疗可有效地改善病人活动性HCMV感染的症状，降低疾病的严重程度和死亡率［4］。因此，建立一种快速特异的诊断HCMV活动性感染的方法具有重要意义。由于HCMV原发感染后, 无论是HCMV潜伏性感染或活动性感染，病毒DNA持续存在于白细胞中。Tanaka 等［6］认为,抗原免疫组织化学方法测定受白细胞数量影响较大,特别不适用于HSCT术后HCMV 活化的早期诊断，而定性PCR即使在HCMV-IgG阴性的正常人或输血后也可出现一过性的PCR阳性，且由于PCR 技术高度敏感,操作过程中的交叉感染也可导致部分假阳性结果,此部分PCR阳性的患者并不代表HCMV处于活动状态,如单纯以PCR阳性作为HCMV 预先清除治疗的指标,不但增加患者的经济负担,也使得患者对细菌及真菌的易感性增加［7］。因此，定性PCR不能区别潜伏性感染和活动性感染，结果对于临床监测HCMV感染有一定的局限性［2，7］。本实验76例HCMV DNA阳性的患者,仅有43例发生了HCMV病感染,其敏感性和特异性分别为95.56%和60.24%,其阳性结果时的预测值仅为56.58%，提示定性PCR在诊断HCMV感染时存在一定的假阳性结果。此外,定性PCR预测HCMV活动性感染症状发作期的作用也不明显,本研究中仅有13例患者在HCMV活动性感染临床症状出现前HCMV DNA定性检测阳性。因而,该检测方法也不适于HCMV活动性感染的早期诊断。HCMV基质外壳蛋白PP67属于晚期阶段基因翻译的病毒结构蛋白-磷蛋白，其基因UL65的转录mRNA是HCMV的一种最主要的晚期mRNA(L-mRNA)。HCMV-L基因转录表示病毒复制的完成,是具有完整病毒循环复制的标志，被认为是HCMV活动性感染最可靠的诊断指标［8］，被越来越多地应用于HCMV感染的临床诊断、药物治疗以及监测预后情况等。Olden-burg等［9］对50例进行胸部器官移植病人术前和术后外周血中的HCMV的L-mRNA进行了检测,并与血清学检测、抗原血症检测和感染的临床症状相比较,认为HCMV LmRNA是一项准确性高特异性强的诊断指标,对指导药物治疗有重要意义。基于核酸序列的扩增技术（NASBA）是1990年由Compton等［10］建立的一种由1对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增技术。该技术不需高温变性步骤, 不需温度循环,整个反应过程由3种酶(AMV逆转录酶，RNase H,T7 RNA聚合酶)控制,循环次数少,可靠性高，不会受到双链DNA的污染，具有较高的敏感性，能有效地快速准确检测和定量多种类型临床标本中的HCMV双链DNA。该技术在HCMV活动性感染的早期，HCMV L基因处于低水平转录的时期就可从外周血单核细胞、多核细胞和内皮细胞中检测到其mRNA［11］。因此检测HCMV L-mRNA有助于早期预测和了解病毒的活动状态,指导临床采取正确及时的预防和治疗措施。在本实验中,45例HCMV病患者中有42例HCMV-PP67 mRNA检测呈阳性，NASBA方法诊断HCMV病的敏感性和特异性为93.33%和97.59%，其阳性结果对HCMV病的预测值为95.45 %，而与HCMV DNA的结果（95.56%、60.24%、56.58%）相比较，敏感性的P值大于0.05，差异没有显著性；而特异性和阳性结果预测值的P值均小于0.05,在统计学上具有显著性差异。在本实验中45例HCMV病患者采用更昔洛韦进行抗HCMV治疗。18例患者HCMV mRNA在治疗疗程结束后检测呈阴性,病毒转阴时间平均为20天；12例患者在抗病毒治疗疗程结束后HCMV mRNA检测仍为阳性，出现更昔洛韦耐药性，再加用或改用膦甲酸钠进行治疗，并减少免疫抑制剂剂量之后，病情迅速好转，其中5例HCMV mRNA转阴，最后康复。另7例患者在治疗过程中，HCMV mRNA一直没有转阴，后因发展成HCMV间质性肺炎导致多器官衰竭而死亡；6例在治疗过程中发生移植物抗宿主反应而死亡；9例在治疗过程中原发病复发而死亡。这说明mRNA的检测结果能够客观的评价抗病毒药物的疗效，对临床抗HCMV治疗具有指导意义。另外在临床实践中，对HCMV感染患者何时开始进行抗病毒治疗比较难以把握。在本实验中，33例HCMV DNA阳性的患者最终没有发展为HCMV病，如果抗病毒治疗是以HCMV DNA阳性为指标，则这部份患者可能属于实际并不需要治疗的患者，他们就可能要承受过度的药物作用，其结果不仅增加患者的经济负担以及药物对身体的毒副作用，而且过早的应用抗病毒治疗可能会使机体的免疫系统不能建立对HCMV的防御，从而导致迟发的HCMV病发生率的增加［8］。综上所述, NASBA法检测HCMV mRNA能够灵敏、特异地监测造血干细胞移植术后HCMV活动性感染,该法还可用于监测抗病毒药物的疗效、指导抗病毒治疗。这对于异基因造血干细胞移植术后指导临床抗病毒治疗和监测预后效果有重要意义。, m; C3 N# C" F( ~ [
【参考文献】
. c0 }, a/ J$ z2 ?( h, ] 1 Zaia JA. Prevention and management of CMV related problems after hematopoietic stem cell transplantation． Bone Marrow Transplant, 2002； 29：633-638
7 X" I$ a% W, z9 L. G% H) u
9 X; M8 R( J. w/ p& J$ P0 A3 Z" [% L
! Z2 D3 o- f. l+ k
2 Diaz-Mitoma F, Leger C, Miller H, et al．Comparison of DNA amplification, mRNA amplification, and DNA hybridization techniques for detection of cytomegalovirus in bone marrow transplant recipients． J Clin Microbiol, 2003； 41: 5159-51663 f7 I4 K' s. m
- b% E) c& E* [% x" g7 x, J- [( O
9 w- ? ]' P9 U: b" m) N5 L! O7 F 3 Bacigalupo A, Bregante S, Tedone E, et al. Combined foscarnet-ganciclovir treatment for cytomegalovirus infections after allogeneic hemopoietic stem cell transplantation．Transplantation,1996；62∶376-380
# X" a. q7 p$ W! f( j+ _6 q% }
! m+ S9 b5 W. D# s c7 E( r
" n5 r4 a0 B9 V4 j0 i7 w
4 Castagnola E, Cappelli B, Erba D, et al．Cytomegalovirus infection after bone marrow transplantation in children． Human Immunol，2004；65：416-422
6 q# c+ {& z& L" ]
( s3 i( r: K( n5 A6 ^; Y$ {$ W7 x7 E- I8 L9 Q: O9 W
X, \8 L7 ?$ P3 o
5 白 海,欧英贤,王存邦等. 异基因外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病. 中国实验血液学杂志, 2003;11:503-507
' ]1 E# f$ u, \) r) L4 Q) E
) w4 o0 Y7 b- Z
! j4 R8 N" K7 w& P& b. n
1 L$ v: u3 Y& V# Q. I0 B 6 Tanaka Y, Kanda Y, Kami M, et al. Monitoring cytomegalovirus infection by antigenemia assay and two distinct plasma real-time PCR methods after hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant， 2002； 30: 315-319
# L* J" e4 m$ B. Z) i6 F: L: ]1 A6 [8 U( O
! |9 Y' X* {4 P+ m6 z" h
/ ~- B! V* i3 V0 w
7 Butt NM,Clark RE. High frequency of positive surveillance for cytomegalovirus by PCR in allograft recipients at low risk of CMV. Bone Marrow Transplant, 2001； 27:615-619 N4 l3 C+ A/ Y9 i5 A! k1 q/ Z/ Z7 ^
a0 C& H& k, g' X, s* d/ _; ?& o, j* R' E
% o( J4 A5 c* k2 E+ _
8 Preiser W, Brauninger S, Schwerdtfeger R, et al．Evaluation of diagnostic methods for the detection of cytomegalovirus in recipients of allogeneic stem cell transplants．J Clin Virol，2001，20：59-70
& E! ~, C) _8 [* z8 e4 k: a7 D- ]+ n
" E, d" p7 [; H1 I! o
4 F, X; E$ B9 F5 o 9 Oldenburg N, Lam KM, Khan MA, et al. Evaluation of human cytomegalovirus gene expression in thoracic organ transplant recipients using nucleic acid sequence-based amplification. Transplantation, 2000; 70:1209-1215
! v) G0 ?& R+ ^4 o$ w% r3 [) N! ^9 m5 H
* t& _2 Y9 K# M3 i
0 t; [1 I; x; H7 X+ l" |
10 Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature,1991； 350(6313):91-92$ ~: _$ x# Q, D- T8 ^! p7 N
# X7 u, X$ g0 K# f- p/ p
$ F B6 ]* D0 { ^) [: \0 Z$ A
! b3 i% L, y; [+ t, q) E 11 Merlino C, Bergallo M, Gregori G, et al. HCMV pp67-mRNA detection by nucleic acid sequence-based amplification in renal transplant patients. New Microbiol， 2002； 25:1-8 |
|
发表于 2009-3-3 12:37
发表于 2015-6-17 08:55
