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作者：常城，陈幸华，孔佩艳，彭贤贵，曾东风，杨文博，梁雪，刘林，刘红，王庆余作者单位：第三军医大学新桥医院血液科，重庆 400037；基金项目：第三军医大学青年创新基金资助课题，编号 XG200526 % E0 |" o9 g* t* Z) f+ g
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【摘要】 本研究探讨全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）能否促进外周血造血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT)预处理致伤的骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSC）功能的恢复。用流式细胞术检测27例造血干细胞移植患者预处理前后BMSC表面细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管黏附分子-1（vascular adhesion molecule-1，VCAM-1）表达，用放射免疫法测定BMSC培养上清液中可溶性ICAM-1（sICAM-1）水平以及BMSC对CD34 细胞的黏附率，并检测浓度分别为0.01、0.1、1 μmol/L的ATRA作用后上述指标的动态变化。结果显示： PBSCT预处理后，BMSC表面ICAM-1和VCAM-1的表达以及 BMSC培养上清液中sICAM-1的表达水平降低，BMSC对CD34 细胞黏附率降低，而在ATRA作用后，BMSC表面ICAM-1表达增加，培养上清液中sICAM-1水平升高，BMSC对CD34 细胞的黏附率增加，但VCAM-1表达变化不明显。结论：全反式维甲酸可部分修复受损的BMSC的黏附功能，有助于促进骨髓造血重建。
0 t7 y6 r6 I1 g' T! I 【关键词】骨髓基质细胞；全反式维甲酸；外周血造血干细胞移植；黏附分子；ICAM-1； VCAM-16 r. j' T0 U G" n
In Vitro Effect of All-Trans Retinoic Acid on Cell Adhesion Molecule Expression and Adhesion Capacity of Bone Marrow Stromal Cells inPatientsReceived Peripheral Blood Stem Cell Transplantation- L* q# q, e8 K3 o8 P: M3 E7 J
. _( m6 {% W( G0 a+ T) v CHANG Cheng，CHEN Xing-Hua，KONG Pei-Yan，PENG Xian-Gui，ZENG Dong-Feng，YANG Wen-Bo，LIANG Xue，LIU Lin，LIU Hong，WANG Qing-Yu
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# M4 P! V$ m6 h+ s Department of Hematology，Xinqiao Hospital，The Third Military Medical University，Chongqing 400037，China Y- R* a5 ?8 W, ^# w
' Z+ O f( R) @2 |1 l* Q; ] Abstract The aim of this study was to evaluate the effect of all-trans retinoic acid（ATRA）on cell adhesion molecule expression and adhesion capacity of bone marrow stromal cells(BMSC) in patients after conditioningtreatment forperi-pheral blood stem cell transplantation (PBSCT). BMSC of 27 patients before and afterconditioningtreatmentfor PBSCT were cultured in vitro. After treated with ATRA at 0.01，0.1，or 1 μmol/L，expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) protein and vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1) protein were detected by flow cytometry，and soluble ICAM-1 (sICAM-1) protein was determined by using radioimmunoassay. Then BMSC was co-cultured with CD34 cells，and adhesionrate of BMSC to CD34 cells was measured. The results showed that after pretreatment with conditioning regimen for PBSCT，the expressions of ICAM-1 and VCAM-1 proteins in BMSC and the expression level of sICAM-1 protein in supernatant of BMSC culture were down-regulated，and the adhesion rate of BMSC to CD34 cells was decreased，after administration of ATRA，the expression of ICAM-1 protein in BMSC，sICAM-1 protein in culture medium andadhesion rate of BMSC to CD34 cells all increased significantly，but expression of VCAM-1 protein changed no significantly.It is concluded that theATRA can partly restore adhesion function of BMSC injured by pretreatment forPBSCTand contribute tohematopoietic reconstitution.
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Key wordsbone marrow stromal cell; all trans retinoic acid; peripheral blood stem cell transplantation; cell adhesion molecule; ICAM-1; VCAM-1" q6 x4 H& S0 M- Y( J
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全反式维甲酸不仅对多种肿瘤细胞有诱导分化和促凋亡的作用，并对骨髓基质细胞黏附分子表达及黏附能力有调节作用。既往研究结果表明，造血干细胞移植后部分患者造血功能恢复缓慢，与移植前接受大剂量化/放疗预处理后骨髓基质细胞表达细胞黏附分子的功能障碍有关［1］。本研究观察在全反式维甲酸作用下，27例外周血干细胞移植患者(peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT)预处理后骨髓基质细胞（BMSC）的黏附能力及细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、可溶性细胞间黏附分子-（sICAME-1）及血管细胞黏附分子-（VCAM-1）等黏附分子表达的变化，探讨其是否具有预防或改善大剂量放疗/化疗所致BMSC损伤，促进骨髓造血功能重建的作用。) B% ?5 f. A/ Q) |. q5 x) M3 o* M7 ?
5 h' K% Q6 A) D4 O5 {/ Z 材料和方法
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病例及预处理方案
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本科室2004年1月至2004年12月收治PBSCT治疗的恶性血液病及实体瘤患者共27例，其中男13例，女14例，年龄8-62岁，中位年龄26岁。急性淋巴细胞白血病(ALL)5例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)10例，非霍杰金淋巴瘤(NHL)9例，霍杰金淋巴瘤(HD)3例。所有病例均经过4-6个疗程以上常规化疗，移植前均给予2-3个疗程大剂量化疗，ALL、HD及NHL应用MTX3.0 g/m2，ANLL应用Ara-C 2.0 g/d3天。
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: o0 [6 l8 h9 y! \ 根据患者具体情况选择环磷酰胺(Cy)/全身照射(total body irradiation，TBI)或不含TBI的方案。Cy均为60 mg/kg2 d，TBI：成人患者照射剂量为8.5-9.0 Gy，分2次照射；年龄在10岁以下的儿童患者照射剂量为7.5-8.5 Gy，分2次照射，剂量率4.6cGy/min。由于10岁以下儿童患者TBI剂量降低，另加用以下化疗药物中的2种： 去甲氧基柔红霉素(ID) 10 mg/m22天，VP16 100 mg/m22天；Ara-C 1.0/m22天，CCNU 0.2/m21天。移植前接受头颅及全脊髓放疗的ALL患者及发病时存在纵隔巨大肿块的淋巴瘤患者均采用不含TBI的方案，方案组成：CCNU 0.2/m21天，Cy 1.5g/m24天，Ara-C 100 mg/ m2，每12小时1次4天，VP16 100 mg/ m24天。
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7 [& V& x- _5 f) w. x" H# \# A0 L 主要试剂
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; W/ d9 l* I' d3 _+ S DMEM（Hyclone公司产品），胎牛血清（FCS）、马血清（HS，PAA公司产品），Ficoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品，比重1.077 g/L)，全反式维甲酸（Sigma公司产品），PE标记抗人ICAM-1(CD54)、VCAM-1(CD106)抗体（eBioscience公司产品），小鼠PE标记IgG1同型对照（晶美公司产品），sICAM-1放免检测试剂盒（北方生物科技公司产品），CD34 细胞分选试剂盒(Miltenyi Biotch公司产品)。8 F$ B7 q8 _( s8 O/ g+ E
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细胞制备及培养8 ?. a( |( c r& R! ^0 ^" ?" X
; `$ K5 q$ g6 ~# _2 j/ g0 r 骨髓基质细胞培养按照本室的常规方法进行［2］，将3 ml抗凝骨髓液与等量含2% FCS的RPMI 1640培养液充分混合，用Ficoll液分离单个核细胞（MNC），洗涤后制成细胞悬液并计数，按2106 MNC/ml接种于含有如下物质的体系：RPMI 1640培养液，HS 12.5%，FCS 12.5%，氢化考的松10-6 mol/L，bFGF 10 ng/ml。以每瓶10 ml的量接种于培养瓶中，置37℃、5% CO2培养箱培养48小时后弃去上清与未贴壁细胞，每周半量换液。
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脐血CD34 细胞制备参照文献［3］进行，收集足月妊娠的脐血并在6小时内分选，以PBS 1∶1稀释，与37℃明胶(3%)等比混合，室温静置至血浆与红细胞界面形成后，吸取血浆层，离心弃上清后悬浮于5 mlIMDM中，用Ficoll液分离MNC备用。抗CD34 细胞抗体与MNC悬液1∶5混匀，4℃孵育20分钟，1∶5加入羊抗鼠IgG1免疫磁珠，8-10℃孵育15 分钟，洗涤后制成单细胞悬液。通过置于磁场中的分离柱，洗脱去除CD34-细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD34 细胞。用流式细胞仪( FACS) 测定其纯度后备用。 a r g) x0 p( S9 J+ q
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实验分组及观察时相点
S0 W% T5 K0 g, z. w$ Q3 L6 S4 {2 X
( Q3 h W1 x W$ w" J1 j# D 根据预处理方案中有无TBI将患者分成Cy组（15例）和Cy-TBI组（12例）。每例PBSCT患者分别在预处理前（before conditioningtreatment，BCT）、预处理后（after conditioning treatment，ACT）第30、90、180天取骨髓进行BMSC培养，动态观测各项指标变化。移植前为对照组。
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- }7 I9 j- Z8 h p6 K) X$ Q 骨髓基质细胞黏附分子的表达检测; w( H* f- [; J5 }. X
. ?" l4 T) `% Y1 B: M 各时相点BMSC进入对数生长期之后，分别加入0.01、0.1、1 μmol/L ATRA共培养24小时，消化并制备成浓度为106/ml细胞悬液，荧光抗体标记，用流式细胞仪检测黏附分子阳性表达率。1 G) r# f$ |: h0 y5 [0 P# [
2 ^0 x! H! W& V F! D 可溶性ICAM-1（sICAM-1）检测. e2 h6 g0 c3 y: N7 E
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取预处理前（BCT）和预处理后（ACT）180天经培养进入对数生长期的BMSC，以1105/well传代于6孔培养板培养，待细胞贴壁伸展铺满底壁后，每孔分别加入ATRA浓度分别为0.01、0.1、1 μmol/L培养基0.4 ml，培养6、12、18、24和36小时后收集培养上清液，送我院核医学科用放射免疫法检测sICAM-1水平。
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$ q- i1 u E, F; l7 N# Q BMSC细胞对CD34＋细胞黏附率检测
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5 C" X- N8 e' r 取预处理前（BCT）和预处理后（ACT）180天经培养进入对数生长期的BMSC，以2104/well传代于24孔培养板培养，待细胞贴壁伸展铺满底壁后，加入ATRA浓度分别为0.01、0.1、1 μmol/L培养液，并培养24小时（各6孔）。吸去上清，每孔接种105个CD34＋细胞，用RPMI 1640培养液培养24小时，轻轻摇动培养板，吸管分别吸出各组的第1-5孔悬浮细胞并计数 (重复3次取均值)，吸管充分吹打各组第6孔，吸取悬浮细胞并计数 (重复3次取均值)，第6孔细胞计数分别减去前5孔细胞计数的值为黏附细胞数，计算黏附率。黏附率计算公式：黏附率(%) =［黏附细胞的细胞数/(黏附细胞 未黏附细胞的细胞数)］100%
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+ W* k: j- i* E p3 |7 K% B/ ] 统计学处理" ]* j- i9 e; {& v0 d- x
7 x1 }, a5 r& ^6 [2 ] 数据结果以均数±标准差（X±SD）表示，应用SPSS 11.0软件进行统计学分析，进行t检验，以P
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; n3 p. R3 P5 i# ~0 P4 E' S2 S! } 结果
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. X) I6 P# B8 Q& [- i ATRA对PBSCT预处理后骨髓基质细胞ICAM-1和VCAM-1表达的影响
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Cy 组及 Cy-TBI 组预处理后各时相点 BMSC 表面ICAM-1和VCAM-1表达率均低于预处理前(P＜0.01)。Cy组于90天时表达率最低，而Cy-TBI组于30天时表达率最低。ATRA浓度为1 μmol/L作用时，Cy组及Cy-TBI组各时相点ICAM-1表达率均明显升高(P＜0.05)，VCAM-1表达率无显著变化(表1、2)。Table 1. Effect of ATRA on the expression of ICAM-1 of bone marrow stromal cells（略）Table 2. Effect of ATRA on the expression of VCAM-1 of bone marrow stromal cells（略）
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ATRA对PBSCT预处理后BMSC sICAM-1表达影响
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; `2 q# ^; Q. s BMSC培养上清液中sICAM-1的含量随培养时间的延长而增加，18-24小时达到高峰。预处理后(AT) BMSC sICAM-1表达水平较预处理前明显降低(P＜0.01)。ATRA浓度在0.1μmol/L和1 μmol/L时，预处理后sICAM-1表达明显增强(P＜0.05)，且ATRA 1μmol/L组对骨髓基质细胞表达sICAM-1的增强作用大于ATRA 0.1 μmol/L组 (P＜0.01)(表3、图1)。Table 3. Effect of ATRA on the expression of sICAM-1 of bone marrow stromal cells（略）1 G0 @1 r1 w, e8 v
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ATRA作用下PBSCT预处理后BMSC细胞对CD34＋细胞黏附率的影响5 c. I* @+ z( ~
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预处理后BMSC对CD34＋黏附率明显降低(P＜0.01)。ATRA在1 μmol/L浓度作用下，可使BMSC对CD34＋的黏附率明显增高(P＜0.01)(表4)。Table 4. Effect of ATRA on the banding rate of bone marrow stromal cells to CD34＋ cells（略）$ e \' `$ D: z! M9 }0 g; A! B
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讨 论0 E4 f! c4 C" ? q! v/ i* b
; O- C# V- S/ C1 N! U 造血干细胞移植后受体造血重建的水平取决于两个因素：一是供者造血干细胞的数量，二是受者造血微环境的质量。然而，造血干细胞移植前强烈的预处理方案可造成骨髓造血微环境的损伤，直接影响移植后骨髓造血重建的过程，是造血干细胞移植时造血重建与恢复不良的重要原因。保证干细胞植入数量同时促进骨髓基质细胞功能，可直接影响造血干细胞移植后造血重建的水平。我们先前的研究发现，PBSCT预处理后造血微环境的损伤可表现在骨髓基质细胞多种黏附分子表达降低和黏附能力下降［4，5］，因此，如何促进骨髓基质黏附功能的恢复对移植后造血重建有积极意义。
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全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）能明显促进BMSC层对造血细胞的黏附能力并上调BMSC表面ICAM-1的表达［6，7］，提示ATRA具有促进BMSC功能的作用，但其是否对预处理后损伤的骨髓基质细胞起作用，尚未见相关报道。本研究证实，预处理后BMSC表面ICAM-1及VCAM-1两种重要的黏附分子表达均明显降低，且BMSC层对造血细胞黏附能力下降，与我室既往研究结果一致。在ATRA作用下，可部分恢复ICAM-1及sICAM-1的水平，ATRA随着其浓度增高，对骨髓基质细胞表达ICAM-1的上调作用增强，这可能是通过ATRA和细胞核内的ATRA受体结合，激活转录因子NF-κB所致［8］。ATRA对VCAM-1的表达作用不明显，提示ATRA对损伤的BMSC黏附分子有选择性调节作用，但机制尚不清楚。在1.0μmol/L ATRA作用下，BMSC对CD34 细胞的黏附能力可明显增高，这可能与上调ICAM-1及sICAM-1表达水平有关。/ i1 F& G6 R, t( V ?& C; H0 p
/ L$ l- n- C1 j: x6 ^( |' r0 |& K造血实质细胞表面整合蛋白分子VLA-4、VLA-5、LFA-1等激活后，分别与BMSC及细胞外基质相应配体Fn、VCAM-1、ICAM-1结合，介导黏附反应，这是促进造血细胞迁徙和归巢的分子基础［9，10］。ATRA可促进损伤BMSC黏附能力的提高及部分黏附分子的表达，这提示ATRA对骨髓基质细胞预处理后的功能损伤有一定的修复作用。有报道，ATRA还可促进BMSC分泌多种细胞因子，提高造血细胞的增殖［11，12］，这说明ATRA有可能从多个方面增强BMSC的功能。深入研究ATRA对BMSC功能的影响，将对临床改善造血微环境、提高造血干细胞移植成功率提供一定实验基础。3 h1 r+ a) I# H6 O
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