移植的神经干细胞在脑损伤区壳聚糖载体中的存活与分化* - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:38 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：衣昕，毛伟峰，田美玲，秦建兵，金国华作者单位：南通大学人体解剖学教研室、神经生物学研究所江苏省神经再生重点实验室，南通226001

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      【摘要】  目的：探讨移植的NSCs在大鼠脑损伤区壳聚糖载体中的存活、分化情况及其对TBI大鼠认知功能的影响。方法：低温冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架。将从鼠胚前脑中分离的NSCs扩增、标记BrdU。Feeney法制备SD大鼠TBI模型，随机分为3组：损伤对照组清创后不做移植；NSCs 支架移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植；NSCs 支架  NGF移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植，并在其中加入NGF。术后1、2、3个月行避暗回避和跳台试验。脑切片行Nissl染色、BrdU与NF-200免疫荧光双标染色。结果：两移植组的认知功能在术后1、2、3个月较损伤对照组明显改善，含NGF的移植组改善更加显著。两移植组术后1、2、3个月在移植区均可见BrdU与NF-200免疫荧光双标细胞，含NGF移植组中的双标细胞数量多、胞体大、突起多且长。结论：大鼠TBI后移植的外源性NSCs可以在脑损伤区壳聚糖载体中长期存活并向神经元分化，可以改善大鼠的认知功能；NGF对其具有促进作用。 + N; U: l  i+ l, b& X" \9 D) ]/ J
      【关键词】创伤性脑损伤；壳聚糖；神经干细胞；移植；神经元；神经生长因子2 \+ D+ t) G- `! f1 U# O

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Survival and differentiation of transplanted NSCs in the chitosan porous
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scaffold within the cerebral cortex lesion of rats
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YI Xin, MAO Weifeng, TIAN Meiling, et al（Department of Anatomy and Institute of Neurobiology, Nantong University, the Jiangsu Key Lab of Neuroregeneration, Nantong 226001）

[Abstract]Objective: To explore the survival and differentiation of transplanted NSCs in the chitosan porous scaffold within the cerebral cortex lesion of rats and the influence on the cognitive function of rats with TBI. Methods:The porous chitosan scaffold was made by Freezing-drying technique. The NSCs coming from rat fetal forebrain were labeled with BrdU. Sprague-Dawley(SD) rats' TBI models were made by Feeney's method. The TBI rats were randomly divided into injury-control group, NSCs scaffold group and NSCs scaffold NGF group. The rats were immediately debrided after injury, then NSCs combined with the chitosan porous scaffold were transplanted into injured cerebral cortex in NSCs  scaffold group, NSCs combined with the chitosan porous scaffold and NGF were transplanted into injured cerebral cortex in NSCs  scaffold  NGF group. Rats were tested for cognitive function using step-through and step-down test at 1, 2 and 3 months postop. Nissl staining and NF-200/BrdU double immunofluorescence were used for brain sections. Results:Significant improvement in cognitive function was observed after transplantation in two transplanting groups, and the cognitive function improvement of rats in NSCs scaffold NGF group was more obvious than that of rats in NSCs scaffold group. NF-200 and BrdU double-labeled cells were detected in the transplantation zone of two transplanting groups at 1, 2 and 3 months postop. The number of BrdU and NF-200 double-labeled cells with more and longer processes in NSCs scaffold NGF group was more than that in NSCs scaffold group. Conclusions:Transplanted NSCs can survive for long time and differentiate into neurons in the chitosan porous scaffold within the cerebral cortex lesion of rats with TBI, which can improve the cognitive function of rats. Ectogenic NGF can accelerate all these changes.
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[Key Words]Traumatic brain injury; Chitosan; Neural stem cells; Transplantation; Neuron; Nerve growth factor" n4 e2 c8 ~* s

创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）是以细胞丢失为主要特征的进行性退行性病变[1]，中枢神经系统（central nervous system, CNS）损伤后的再生一直是困扰人类的难题。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）因具有自我更新、多分化潜能等特性，为移植NSCs治疗TBI提供了广阔的应用前景。本文通过Feeney法（1981）建立大鼠TBI模型，清创后行壳聚糖作载体的NSCs移植治疗，检测NSCs在大鼠脑损伤区壳聚糖载体中的存活及和移植NSCs对TBI大鼠后认知功能的影响，为应用NSCs移植治疗TBI提供理论和实验依据。

1材料与方法
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1.1动物与分组220~240 g SD大鼠54只（本校实验动物中心提供），雌雄不拘，随机分为损伤对照组、NSCs 支架移植组和NSCs 支架 NGF移植组各18只，每组又分为术后1个月、2个月、3个月 3个时相点，每组各时相点均为6只。

1.2壳聚糖多孔支架的制备将壳聚糖溶于1%乙酸中制备成2%（W/V）的溶液,加入24孔细胞培养板各孔中，每孔1 ml，于4℃预冷6 h，置于-28℃中过夜，再在-60℃下冷冻干燥24 h。然后向每孔中加入0.1 mol/L NaOH 1 ml水化20 min，再用pH 7.2的0.01 mol/L PBS清洗3次,最后再进行两次冷冻干燥。接种细胞前用70%乙醇灭菌后，用无菌生理盐水浸洗3次，最后在密封条件下经紫外灯照射20 min。6 \5 ?7 m. B0 y6 a6 x

1.3TBI模型制备参照Feeney TBI模型法，动物经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent（0.2 ml/100g）麻醉后，将头部固定于立体定位仪，颅顶剃毛、消毒，切开头皮直至颅骨外骨膜，以前囟后方3.5 mm 、左侧2.5 mm 为中心，用手术刀切除一边长为5 mm的正方形骨瓣形成骨窗，保持硬脑膜完整。在骨窗上方垂直固定Feeney's模型打击装置，致伤高度25 cm，致伤物重20 g，致伤力度为500 g·cm。1 |" Y% C) i6 G/ @+ q* h

1.4损伤对照组处理损伤对照组致伤后，立即切开硬脑膜，进行清创处理，消毒生理盐水冲洗后，缝合切口，青霉素10万U肌肉注射，动物清醒后按性别分笼饲养。

1.5NSCs移植

1.5.1鼠胚NSCs克隆球的制备取孕15 d SD大鼠1只，腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent（0.2 ml/100g）。无菌条件下取出鼠胚置无血清DMEM培养基中，分离出前脑,剔除脑膜和脉络膜，参照谭雪锋等[2]报道的方法进行NSCs的分离培养、原代克隆。按黄镇等[3]报道的方法进行单细胞克隆和扩增。6 M" D" S: z) ~7 {# t' I
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1.5.2NSCs的5-溴-2-脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxy-uridine，BrdU）标记在传至第3代的鼠胚NSCs培养液中加入无菌抽滤BrdU, 使BrdU的终浓度为5 μmol/L。置饱和湿度的37℃、5%CO2培养箱中培养7 d后，得到BrdU标记的第4代亚细胞系神经干细胞克隆球。6 u6 ]8 {- Q8 q: F
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1.5.3壳聚糖作载体的NSCs移植清除两移植组TBI模型打击部位血肿，清创处理待无出血后，裁剪形态适宜的壳聚糖多孔支架填塞于清创部位，然后取第4代NSCs克隆球以1105个/ml的密度接种于壳聚糖多孔支架上，NSCs 支架  NGF移植组接种液中含有100 ng/ml NGF。缝合切口，青霉素10万U肌肉注射，动物清醒后按性别分笼饲养。! W, l5 E4 L( {% L

1.6行为学检测测试仪器和方法同金国华等[4]报道。制备TBI模型前经避暗回避试验检测，3组大鼠的行为学无差异。术后1、2、3个月进行（1）避暗回避试验：记录3组大鼠第3 d的探索次数和第6 d的滞留时间；（2）跳台试验：避暗回避试验结束后进行，记录第7 d的主动和总回避阳性率。  [' h8 _* A1 Y1 v6 t
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1.7脑组织切片的制备行为学检测完毕，大鼠经上述方法麻醉后，开胸经心先后灌注生理盐水100 ml及含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 400 ml，取脑后固定6 h。再分别经20%、30%蔗糖平衡，行冠状位冰冻连续切片，片厚20 μm。共收集2套切片，均贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上待染色。
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1.8切片染色
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1.8.1Nissl染色取上述各组一套切片，用焦油紫行Nissl染色，常规脱水、透明、封片, 镜下观察。) Y# r' {9 L' |1 r4 E& w- t
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1.8.2BrdU与神经丝蛋白-200（neurofilament-200，NF-200）免疫荧光双标记取上述各组一套切片，用0.01 mol/L PBS（pH 7.2）漂洗后，每张切片滴加10%山羊血清50 μl封闭过夜，吸去山羊血清每张切片滴加含有1∶150稀释小鼠抗BrdU单克隆抗体（Sigma公司）和1∶200稀释的兔抗NF-200的多克隆抗体（Chemicon公司）50 μl， 4℃湿盒孵育24h。用0.01 mol/L PBS（pH7.2）漂洗3遍，在避光条件下，每张切片滴加含有1∶200稀释的FITC标记的山羊抗兔的二抗（Sigma公司）和1∶500稀释的结合有Alex Fluor 568荧光素的山羊抗鼠的二抗（Molecular Probes公司）50 μl，4℃湿盒孵育24 h。在避光条件下，PBS洗片3遍后，中性甘油封片。先后在激发光波长为578 nm、吸收光波长为603 nm和激发光波长为495 nm、吸收光波长为520 nm的荧光显微镜下观察BrdU与NF-200阳性的免疫荧光细胞并摄片。$ x& k& r. J5 B: c! t% T* Z
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1.9图像处理和统计学方法将NSCs 支架移植组、NSCs 支架  NGF移植组摄取的荧光照片导入计算机中，利用捷达801系列形态学分析软件计数移植区200倍视野内BrdU与NF-200免疫荧光双标阳性细胞数、胞体面积和细胞（包括突起）周长。每只大鼠均取4张切片相应部位的平均值作为统计数据。
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采用Stata7.0统计软件，对3组大鼠避暗回避试验的探索次数和滞留时间以及跳台试验的主动和总回避阳性率行方差分析；对两个不同移植组BrdU与NF-200免疫荧光双标阳性细胞数、胞体面积和细胞周长行t检验。
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2结果- n3 g/ K$ x6 f3 [  l
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2.1行为学检测! L/ N7 X( Z3 ?7 _

2.1.1避暗回避试验移植术后1、2、3个月3个时相点，两移植组较损伤对照组大鼠探索次数明显逐渐减少，滞留时间明显逐渐延长，而且NSCs 支架 NGF移植组大鼠在相应时相点探索次数更少，滞留时间更长。术后3组大鼠避暗回避试验探索次数和滞留时间以及统计结果见表1。
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2.1.2跳台试验移植术后1、2、3个月3个时相点，两移植组较损伤对照组大鼠第7d主动及总回避阳性率明显逐渐升高，而且NSCs 支架 NGF移植组大鼠在相应时相点主动及总回避阳性率更高。术后主动回避阳性率和总回避阳性率以及统计分析结果见表2。4 ]) G# j: v% [

2.2Nissl染色损伤对照组创伤区可见到烧杯状缺损，创伤侧海马严重萎缩变形，见海马CA3区及齿状回细胞排列紊乱、丢失。两移植组创伤区有移植物填充，移植物中均可见到许多尼氏阳性细胞，术后3个月时移植物均已经与宿主整合，壳聚糖支架已经部分降解，创伤侧海马CA3区及齿状回的细胞虽有排列紊乱和丢失，但萎缩变形不明显。
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2.3BrdU与NF-200免疫荧光双标记损伤对照组结果为阴性。两移植组中BrdU的标记呈红色，NF-200的标记呈绿色。相同视野不同激发光和吸收光波长下所摄取的照片经软件重叠处理可见移植区中BrdU与NF-200双标细胞的胞核呈红色，胞浆及突起呈绿色。NF-200阳性细胞BrdU绝大多数也为阳性。

2.3.1术后1个月BrdU与NF-200免疫荧光双标记术后1个月两移植组移植区中均可见到BrdU与NF-200双标细胞，胞体小，多为梭形或圆形，但未见到有突起伸出。NSCs 支架移植组（图1）BrdU与NF-200阳性的双标细胞数较NSCs 支架 NGF移植组（图2）少。) r; V3 e6 p! D: M, |# x4 y
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2.3.2术后2个月BrdU与NF-200免疫荧光双标记术后2个月两移植组移植区中BrdU与NF-200双标细胞数量未见明显变化，但胞体变大，多为圆形，部分细胞可见到有较短的突起伸出，而且NSCs 支架移植组（图3）中短突起的双标细胞明显少于NSCs 支架 NGF移植组（图4）。( l$ Z- q% f" m7 P

2.3.2术后3个月BrdU与NF-200免疫荧光双标记术后3个月两组移植物均已与宿主整合。NSCs 支架移植组（图5）BrdU与NF-200双标细胞形态比较成熟，但具有长突起的双标细胞较少，而NSCs 支架 NGF移植组移植区中BrdU与NF-200双标细胞形态更加成熟，细胞的突起较长，移植区与宿主交界区少数阳性细胞的突起已延伸至宿主脑组织（图6）。0 X4 W& ]0 V: a! R% R
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术后1、2、3月两移植组BrdU与NF-200免疫荧光双标细胞数、胞体面积、细胞周长以及统计分析结果见表3。$ i# W  L) M" P3 z. P
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3讨论7 a* u' r# _2 ]% `) {8 V

以往TBI的治疗侧重于药物治疗以减轻急性期的继发性脑损伤和提高慢性进展期存活脑组织的功能，而应用NSCs治疗TBI只在最近才开始被研究。虽然NSCs存在于多个脑区，但自体NSCs应对脑损伤产生新神经细胞的能力有限，而且诱导脑区自体NSCs定向迁移与分化的研究尚未取得突破性的进展。因此移植外源性细胞治疗脑损伤成为主要的研究方向之一。可供移植的细胞种类很多，如永生化祖细胞、NSCs、胚胎神经组织、骨髓基质细胞、脐血细胞、有丝分裂后神经元等，由于NSCs具有多向分化潜能、低免疫原性、取材容易、来源广泛等特点，因此在细胞移植治疗方面，无论从临床应用，还是伦理角度都显示出了更大的优势[4]。
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外源性NSCs在移植部位微环境中的存活是迁移、分化的前提条件。移植物的存活可能与移植细胞组织类型、移植途径、移植时间及部位等因素有关[6]。为了更好地模拟临床治疗，避免造成二次损伤，本实验在创伤急性期即在损伤区行壳聚糖作载体的NSCs移植。在脑损伤急性期创伤侧的皮质、海马等结构中有许多引起继发性脑损伤的细胞因子或毒素的释放，但这些微环境表达的蛋白如nestin和cyclinD1等为损伤区提供了类似于胚胎期的微环境，从而使得NSCs能够存活[5~8]，本实验中术后1、2、3个月均检测到BrdU标记的阳性细胞也证实了这一点。移植物的长期存活是移植成功与否的关键，本实验在移植术后3个月仍能检测到较多BrdU标记的阳性细胞，这可能与壳聚糖支架的应用不无关系，体外实验已证实壳聚糖具有良好的生物相容性[9]，脑损伤区壳聚糖多孔三维支架为移植的细胞提供了获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，为形成新的具有形态和功能的组织提供了结构基础。同时，移植的NSCs可表达一些神经递质受体，CNS中的神经递质可促进NSCs的存活和增殖[10]。NSCs具有低免疫原性，脑又是相对的免疫豁免器官，从而有利于移植细胞的长期存活。! G5 u; i5 D6 @1 a

研究认为外源性NSCs的分化是由局部微环境所决定的。NSCs能对周围的信号做出反应，如脑损伤后局部表达的白介素(interleukin, IL)能促进NSCs向神经元方向分化；碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-basic，bFGF)、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor , LIF)等能促进NSCs增殖；神经生长因子家族均有促进NSCs分化的作用[11]。而损伤局部神经胶质细胞的增生、脑局部组织间液类似血清的成份、神经营养因子减少或消失等各种综合环境均可诱导存活的NSCs更多地向胶质细胞方向分化[12]。本研究NSCs 支架 NGF移植组中，由于在NSCs微环境中加入了NGF，移植的NSCs较没有NGF的NSCs 支架组中的NSCs更易向成熟神经元分化。但如何获得更多的分化神经元还需要进一步研究。& Y0 L) }8 |2 b  ^  {/ n, G% w
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本研究在认知行为学检测中，损伤对照组的学习、记忆功能明显降低，移植组的学习、记忆功能在术后1、2、3个月明显逐渐得到改善，其中NSCs 支架 NGF移植组改善得更加明显。这可能与NSCs在损伤区分化成了所需神经元，，重建了局部神经环路代偿了损伤神经细胞的功能有关。可能还与移植的NSCs能够产生或分泌神经营养因子，促进脑损伤后的神经系统功能的恢复[13] ，同时也改善了TBI后的局部微环境，从而也减轻了TBI后继发性神经功能损害有关。
      【参考文献】
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