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作者：张春华作者单位：山东大学山东省立医院妇产科， 济南 250021
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【摘要】 探讨细胞因子不同的组合方式对人骨髓CD34＋富集细胞及AC133＋富集细胞体外扩增潜能的影响。方法 常规富集人骨髓CD34＋及AC133＋细胞,应用本研究组设计并已经证实的细胞因子组合方式，对人骨髓CD34＋及AC133＋富集细胞进行体外对照培养，分别观察CD34＋和AC133＋富集细胞的扩增情况；应用甲基纤维素半固体培养法，观察不同组别培养7、14、21?d CD34＋和AC133＋富集细胞的集落形成情况及细胞凋亡率。结果 AC133＋细胞实验组在相同条件下细胞扩增倍数以及集落生成数目上均明显高于CD34＋细胞实验组，相同条件下细胞凋亡率明显低于CD34＋细胞实验组。结论 AC133＋细胞包含有更多原始的造血干细胞，AC133作为造血干细胞抗原标记明显优于CD34。
5 d' v. y) X5 }, E' | 【关键词】人 骨髓 造血干细胞 AC133＋细胞 CD34＋细胞 体外1 a0 k- ^& u1 G, Q o7 x7 ^- i
ZHANG Chunhua1, WEN Zeqing1， ZHU Yong2
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(1. Department of Obstetrics and Gynecology，Shandong Provincial Hospital, Shandong University,
5 U$ z$ S: @0 x# ~+ D7 J5 A2 `) i, f2 Z/ f5 W2 c
Jinan 250021，China; 2. Department of Surgery, Affiliated Hospital of Shandong University of/ `. i. I6 T/ d8 U% Q
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Traditional Chinese Medicine, Jinan 250021，China)
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' b8 E) u7 J$ CAbstract: ObjectiveTo explore the effects of different cell factor combinations on human bone marrow CD34 cells and AC133＋ cells ex vivo. MethodsCD34 cells and AC133＋ cells were gathered by MiniMACS, then the cell factors were divided into 6 groups. Through the ex vivo comparison cultivation under different cell factor combination stimulation, expansion of the CD34 and AC133＋ selection cells was observed and the clone formation of the CD34 and AC133＋ cells was also observed by using Halfsolid Methyl cellulose under different cell factor stimulation (during 7?d, 14?d, 21?d.). The rate of cell apoptosis was determined. ResultsThe number the expansion folds and clones of the AC133＋ selection cells were higher than those of the CD34＋ selection cells under the same condition(P＜0.05).The rate of cell apoptosis from the AC133 selection cells was lower than that from the CD34 selection cells(P＜0.05). ConclusionThe AC133 cells contain more hematopoietic progenitor cells than the CD34 cells.# |' X6 m" m/ W8 G# ?* Y/ B
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Key words: Bone marrow; Hematopoietic stem cells; AC133＋ cells; CD34＋ cells; Cytokines0 @2 i/ p9 x2 v% n7 I
c. ?" S! u1 O- v恶性肿瘤患者在自体骨髓移植中如何有效地筛选造血干细胞，真正有效的在短期内获得大量扩增早期造血干/祖细胞及各阶段造血前体细胞，以缓解症状及维持造血仍然是困扰着人们的难题。过去的十几年来,CD34抗原一直被作为造血干/ 祖细胞的标记而广泛应用于基因治疗和造血干细胞扩增及移植领域。但越来越多的证据表明AC133是一种新的造血干细胞表面抗原，并提示AC133＋抗原可能是一种比CD34＋抗原更早期的造血干细胞表面标记［1］。本研究对人骨髓中AC133＋细胞的功能特征与CD34＋细胞进行了对比研究,旨在进一步探讨AC133抗原在正常人造血细胞中表达的意义,为有效分选、扩增造血干/ 祖细胞提供可靠的实验依据。
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+ k& T! i# L7 R9 [7 D1材料与方法% l6 i# K) _3 @
% H% L( _$ A, `; o9 k% v" g# a1.1材料8例人骨髓细胞的获取来自山东省立医院胸外科无血液疾患同时无病原体感染的开胸病人（知情同意）。FicollHypaque购自上海第二试剂厂；CD34＋和AC133＋细胞选择试剂盒购自德国MilienyiBiotech公司；TUNEL凋亡试剂盒购自美国R＆D公司；马血清、人AB血清、胎牛血清、谷氨酰氨、2巯基乙醇、细胞因子：干细胞因子（SCF）、Flt3配体（FL）、白介素3（IL3）、白介素6（IL6）、粒细胞集落刺激因子（GCSF）、粒巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）均购自美国sigma公司。 R; B8 }- T; C9 l
- r, I8 W2 y" \1 Q1.2方法
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6 i7 q8 F+ ^% e9 n- E# K2 b/ M4 a4 s1.2.1人骨髓单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)的采集和制备获取的骨髓细胞常规用比重为1.077?g/mL的FicollHypaque分离获得MNCs，1?500?r/min 离心10?min，培养液调整细胞数(1 5)108/mL?待用，并常规胎盘兰检测细胞活性。# ]& d, W/ r# m( P7 c/ a( }5 V
& t4 x8 [$ I* ~0 X8 A; k1.2.2CD34＋及AC133＋细胞的分离纯化采用 MiniMACS(磁珠细胞分选)免疫磁性吸附柱分离装置，将获取的MNCs分别用CD34＋AC133＋细胞选择试剂盒按说明进行CD34＋和AC133＋细胞的分离与纯化。获得富集的CD34＋和AC133＋细胞。
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+ i% q* ^: r/ z/ m1.2.3干细胞体外扩增体系1?mL IMDM培养体系中包含10%马血清、10%人AB血清、10%胎牛血清、2?mmol/L谷氨酰氨,110-4?mol/mL 2巯基乙醇，其中细胞因子组合为:SCF 50?ng/mL,IL3 5?ng/mL,IL6 50?ng/mL,FL 50?ng/mL,GCSF50?ng/mL，GMCSF 50?ng/mL。不同的细胞因子组合共分为7组。第1组：GMCSF GCSF IL3 IL6 SCF；第2组：GMCSF GCSF IL3 IL6 SCF FL；第3组：IL3 IL6 SCF FL；第4组：IL6 SCF FL ；第5组：IL3 IL6 SCF；第6组：阶梯组合，培养第1周IL3 IL6 SCF，第7天同时加FL一直到第4周结束，第14天起停用IL3；第7组对照，不加细胞因子。培养实验在24孔板中进行,每孔1?mL培养液,细胞接种密度为1104/mL，于37?℃、5%CO2的全饱和湿度下培养。培养至第7天开始半量稀释换液,每周换液2次,在培养开始及7、14、21、28?d分别计算细胞总数，同时收集0、7、14、21?d半量的细胞悬液做集落培养。
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1.2.4半固体集落培养采用甲基纤维素半固体集落培养法。IMDM培养基中分别加入新鲜分离的人CD34＋、AC133＋富集细胞，7组细胞因子组合刺激下培养7、14、21?d的CD34＋，AC133＋富集细胞，种植密度为1105个/mL,0.8％甲基纤维素，30％马血清，10％人AB血清蛋白，110-4?mol/mL 2疏基乙醇以及SCF 50?ng/mL,IL3 5?ng/mL,IL6 50?ng/mL,FL 50?ng/mL,GCSF50?ng/mL,GMCSF50?ng/mL。8孔板培养,每组种3孔，于37?℃、5%CO2的全饱和湿度的孵箱里培养14?d，于倒置显微镜下直接观察, 行集落计数（细胞团的直径＞0.5?mm为一个集落），取3平行孔的平均值。( q- r W" C- A- l4 t( U: P
, [7 d' R( O! w5 H4 i- z1.2.5凋亡检测取培养0、7、14、21?d的不同细胞因子刺激下的CD34＋以及AC133＋富集细胞，TUNEL法行凋亡检测，按说明书进行。在光学显微镜下，任意选取视野，共计数500 1?000个细胞，计数其中凋亡的细胞，计算凋亡率，并记录结果。凋亡阳性细胞表现为细胞核的形态不规则（染色质凝集、核固缩），核中有棕黄色颗粒局部或弥漫性分布。凋亡阴性细胞表现为细胞核形态规整，核染色呈均匀的淡绿色（甲基绿染色）。凋亡率＝凋亡阳性的细胞数/细胞总数100％。6 Q+ i" d5 f/ ^3 `, b7 ^
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1.3统计学处理采用SPSS10.0软件，各项计量结果以±s表示，组间比较应用Student′s t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。% J4 I+ M( [, z
1 w7 K6 W1 o" d: r. y3 l: c2结果
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a$ z1 G9 A% C3 X; S2.1造血细胞免疫表型分析8例人骨髓中，MACS分离的CD34＋细胞的平均纯度为96.1%，AC133 细胞的平均纯度为95.8%；相同细胞浓度的CD34＋和AC133 富集细胞其CD34＋和AC133 细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）。
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2.2细胞总数扩增分析见表1。由表1可见，骨髓AC133 富集细胞在培养过程中，除组合1外细胞扩增倍数均呈持续上升趋势，且细胞因子组合2、6有明显优势,P均＜0.05；对于骨髓CD34＋富集细胞，其扩增趋势与AC133＋富集细胞大致相似，但是相同条件下，骨髓AC133＋富集细胞和骨髓CD34＋富集细胞在14、21、28?d差异均有统计学意义, P均＜0.05，AC133＋富集细胞扩增倍数大于CD34＋富集细胞。7 x# m. a$ s: K n3 z, Y$ S! r
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2.3造血干细胞集落形成情况见表2。由表2可见，CD34 富集细胞的集落密度则由培养开始时的2?951.3个/105细胞持续下降,没有上升趋势，但组合6的阶梯组合方式培养的细胞再行集落培养，集落形成数目下降趋势相对缓慢，P＜0.05。AC133＋富集细胞在相同条件下保持和CD34 富集细胞相同的集落生长趋势，但是AC133＋富集细胞生长的集落数目明显高于CD34＋富集细胞(P＜0.05)。且无论对于CD34＋富集细胞还是AC133＋富集细胞，细胞因子组合3、4在培养14?d再行集落培养，细胞因子组合3优于细胞因子组合4，而培养至21?d再行集落培养，二者相差不大。＃P＜0.05 vs 组合4；*P＜0.05 vs 组合5，P＜0.05 vs 相同条件下骨髓AC133＋富集细胞各实验组。2.4细胞凋亡分析见表3。无论是对于骨髓CD34＋富集细胞还是骨髓AC133＋富集细胞，采用不同的细胞因子组合不能抑制细胞凋亡的增加,随着培养时间的延长，凋亡细胞的比例呈逐渐上升趋势。但骨髓CD34＋富集细胞各实验组细胞的凋亡比率在相同培养时间明显高于骨髓AC133＋富集细胞各实验组，P＜0.05。±s）
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3 f8 {( o, o0 Y! l3 w! |/ ~3讨论
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化疗在现在的临床肿瘤治疗中起着重要作用。然而，化疗药物在抑制杀灭肿瘤细胞的同时，多会导致粒细胞下降明显，输注造血干细胞成为解决以上问题的良好选择［23］。但异体干细胞移植存在排斥反应，移植后需免疫抑制支持，而大大限制了其在临床的开展。而采用小剂量自身骨髓造血细胞体外扩增后自体干细胞移植是克服以上不足的有效方法，具有非常重要的现实意义［4］。造血干细胞是造血组织中的核心成分，只有依靠这类细胞的增殖和分化才能维持造血组织的功能和血细胞数量的恒定。CD34抗原是区分和纯化造血干细胞最常用的细胞表面标志,其在干/祖细胞上高表达，并且随细胞的分化成熟表达降低。然而,CD34 细胞是异质性的群体,并且仅包含一部分造血干细胞,现已发现有CD34-细胞也具有造血干细胞活性［56］。Miraglia等［7］报道了一个新的造血干细胞表面抗原AC133,并成功制备了识别该抗原的单克隆IgG抗体。有研究显示，AC133 细胞可能较CD34 细胞更为原始，具有更强的增殖潜能，含有更多的原始的造血干细胞［89］，但是对于人骨髓AC133 细胞的体外生物学特性研究的报道仍然很少。' X0 r7 G) p0 B8 B. {+ C
^) U1 p' z, F本研究对比了人骨髓AC133＋富集细胞、CD34＋富集细胞在体外扩增，集落生成以及细胞凋亡之间的差异，结果显示不论是体外扩增、集落生成还是细胞凋亡，这两种细胞在不同细胞因子组合刺激下均表现出类似的趋势。但相同细胞因子组合刺激下相同数量的人骨髓AC133＋细胞体外扩增倍数明显高于CD34＋细胞，并相同条件下集落生成的数量也明显高于CD34＋细胞，说明人骨髓AC133＋细胞包含有更多更原始的造血干细胞，具有明显高于CD34＋细胞的增殖潜能；另外，即使应用经本研究组证实了的既维持造血干细胞自我更新的能力又在很大程度上扩增了造血祖细胞的细胞因子组合方式6，对于骨髓CD34＋细胞和AC133＋细胞，随着培养时间的延长凋亡率增加仍不可避免。说明骨髓造血干细胞体外扩增伴随着时间的延长细胞分化明显增加，分化成熟的造血细胞不能无限制的存活，凋亡增加不可避免。但在相同条件下，人骨髓AC133＋细胞实验组的细胞凋亡率明显低于CD34＋细胞实验组，结合细胞集落生成的检测，更加证实了AC133＋细胞包含有更多原始的造血干细胞，作为造血干细胞抗原标记明显优于CD34。- Q4 x9 o) y) H& \3 h/ d8 V
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