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[请教] 引物合成 [复制链接]

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楼主
发表于 2010-12-25 16:20 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
请教有扩增4kb左右的片段是,引物序列长度于小于1000bp的片段相比是不是应该长一点
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沙发
发表于 2010-12-27 16:23 |只看该作者
4KB片段PCR本身不太容易扩,引物序列最好长点!
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藤椅
发表于 2010-12-27 21:22 |只看该作者
引物长短倒没有太大影响,用合适的酶就行了,有些聚合酶是专门扩长片段的,你可以咨询厂家。不过要是在质粒上扩的话,普通的taq酶也可以,我试过扩4200bp的。
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板凳
发表于 2010-12-30 08:00 |只看该作者
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引物合成最要紧的是特异性,长不长不要紧,关键是Tm值要够。- z6 I; }0 r  U+ `! @  {! C
楼主要的什么基因?
/ N9 Z+ q$ @/ Q. {/ `
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报纸
发表于 2010-12-30 08:22 |只看该作者
本帖最后由 鹤顶宏 于 2010-12-30 08:23 编辑
1 ?. Z) X/ O/ t& X" `& j4 \" f2 }. v! r8 s  [, V
回复 weiyepan 的帖子- i' F3 t& c  g' r( G; e3 a

" g) r: \) B8 k! H: Q8 h" v猪抑制素的基因,
! l5 Q' U% z, T  r6 TTm值要够是什么意思,还望大虾明说一下
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发表于 2010-12-30 16:56 |只看该作者
正常的引物就可以 25BP吧
, f5 E; w" ~: u0 v5 r1 i/ W关键怕扩增不了的话用阔长片段的酶4 a8 H8 J9 o% b( e( q0 O) p
这种酶不少,TAKARA有一种叫 LA taq的酶 专门扩增长片段,似乎配有专门的BUFFER,买来看说明书直接就用了,和普通TAQ扩增方法一样的
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发表于 2010-12-31 08:09 |只看该作者
Takara的酶扩增是可以,不过突变率太高,基本上1000~1500会有一个突变,我们基本上现在不用。& y) {; o/ ^" \5 u" x+ C: p5 W
我们一般还是用NEB的Fusion酶,配takara的buffer,括高GC的很好用。
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发表于 2010-12-31 08:11 |只看该作者
回复 鹤顶宏 的帖子. X+ e) U" [/ g* F: H1 |
& J! |$ q$ b+ Y0 |
设计引物现在我们一般用Primer5,自动算Tm,一般Tm拉到55以上,然后错配的自由能不高于20,这样的引物比较好用。
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发表于 2011-1-1 09:33 |只看该作者
回复 weiyepan 的帖子5 r) t" T$ h+ Y/ S: ^" A: l

- j$ {0 j  w) W% j1 d3 t, c# {2 H谢谢,元旦快乐
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