引物合成

鹤顶宏

请教有扩增4kb左右的片段是，引物序列长度于小于1000bp的片段相比是不是应该长一点

痞子的烟头

4KB片段PCR本身不太容易扩，引物序列最好长点！

绿雪

引物长短倒没有太大影响，用合适的酶就行了，有些聚合酶是专门扩长片段的，你可以咨询厂家。不过要是在质粒上扩的话，普通的taq酶也可以，我试过扩4200bp的。

weiyepan

引物合成最要紧的是特异性，长不长不要紧，关键是Tm值要够。- z6 I; }0 r  U+ `! @  {! C
楼主要的什么基因？
/ N9 Z+ q$ @/ Q. {/ `

鹤顶宏

1 ?. Z) X/ O/ t& X" `& j4 \" f2 }. v! r8 s  [, V
回复 weiyepan 的帖子- i' F3 t& c  g' r( G; e3 a

" g) r: \) B8 k! H: Q8 h" v猪抑制素的基因，
! l5 Q' U% z, T  r6 TTm值要够是什么意思，还望大虾明说一下

l123w456x789

正常的引物就可以 25BP吧
, f5 E; w" ~: u0 v5 r1 i/ W关键怕扩增不了的话用阔长片段的酶4 a8 H8 J9 o% b( e( q0 O) p
这种酶不少，TAKARA有一种叫 LA taq的酶 专门扩增长片段，似乎配有专门的BUFFER，买来看说明书直接就用了，和普通TAQ扩增方法一样的

weiyepan

Takara的酶扩增是可以，不过突变率太高，基本上1000~1500会有一个突变，我们基本上现在不用。& y) {; o/ ^" \5 u" x+ C: p5 W
我们一般还是用NEB的Fusion酶，配takara的buffer，括高GC的很好用。

weiyepan

回复 鹤顶宏 的帖子. X+ e) U" [/ g* F: H1 |
& J! |$ q$ b+ Y0 |
设计引物现在我们一般用Primer5，自动算Tm，一般Tm拉到55以上，然后错配的自由能不高于20，这样的引物比较好用。

鹤顶宏

回复 weiyepan 的帖子5 r) t" T$ h+ Y/ S: ^" A: l

- j$ {0 j  w) W% j1 d3 t, c# {2 H谢谢，元旦快乐