关于梯度离心

文武庙

梯度离心时 淋巴细胞未成层 而是一个一个小颗粒状在血浆和血细胞之间 是怎么回事？如何提高梯度离心细胞回收率？3 Z7 v2 ]7 h8 @( X3 E
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hanwei0610

不知道你想做的是哪个物种的，不同的物种来源，细胞比重不同，首先要选择好针对性的细胞分离液！! d9 p0 u# ]+ E4 U8 l+ J0 d; `
下面是我以前的实验步骤，希望对你有用！  e% e7 P* r2 z8 L% S6 V
    外周淋巴血细胞分离（ficoll密度梯度离心法）
3 u- M4 L: q2 x9 J1.肝素抗凝静脉血，用Hank’s液约等体积或2倍体积稀释% b* ]+ [* j) I7 J# D
2.用滴管轻轻加到 FICOLL上，注意：动作要轻，缓，血液层和FICOLL层的界面要清晰。FICOLL和稀释后的血的体积比甚至可以达到1：4
! a% |6 P6 o& k- W$ `0 D* G3.离心:温度为25 度，2000rpm 20分钟# G, d) ?6 d) \; P
4.离心后吸取中间的白色云雾状狭窄带（注意不要吸到FICOLL层），置于另一试管中6 N  D: v8 R5 B( W2 q# i
5.加入尽可能多的 Hank’s液洗涤吸取的细胞，1600rpm 8分钟，洗2次3 d; f# t' M# a' q- c. ~) G
6.细胞计数，将细胞以一定的浓度种到培养板中，加入营养液培养。6 ~# s; `% T8 P( z- n2 ~4 ?8 M
注意事项：分离的时候特别要注意温度，FICOLL和Hank’s液以及营养液使用之前要37度温一下；& `+ |  r9 P# ]" A" I
          血液层和FICOLL层的界面清晰；: j  d8 P5 D0 A
          FICOLL离心温度为25度，不能使用离心机上的brake功能。
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xuehu20

同意楼上，不过有几点不同，离心温度一般设为16度，同时设定离心时的升降速，分别为升6降5，Hank’s液洗细胞时也得注意离心，离心转速过高或者离心时间过长都会对细胞造成伤害，不同离心机转速不同具体合适速度得自己摸索。
( r5 H) m8 D( b不过不明白楼上为什么要预热FICOLL和Hank’s液，降低对细胞的损害？有效果吗？

文武庙

回复 hanwei0610 的帖子8 d8 H+ ^% V9 H" X# Q6 q) h

) I0 J+ E- u+ Q; d# V/ y1 m) a0 E步骤与你基本一致，只是我一直用生理盐水代替Hank‘s液，之前分的不错，今天的问题不知道是不是与采集的血有关系；另外请问，做流式细胞，细胞浓度多少合适？

zuming

离心后吸取中间的白色云雾状狭窄带5 d2 j& ~( E  a; f9 e- s3 t0 X8 r
这一步不是那么容易做的，在50ml的离心管里吸取那么一条细小的条带很是麻烦，不知各位都是怎么做的，请教一下。

frogyan

不知道2楼用的是哪种分离液。我用的sigma的Histopaque-1077, 说明书上提醒要用400g离心exactly 30 min，然后PBS洗两次，每次洗都要求250g 10min。并且如果离心机有刹车功能的最好把刹车关掉，让它自然减速到静止。

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有没有做 宫颈脱落细胞梯度离心的？ 谈谈经验呢

sijicc

回复 hanwei0610 的帖子: X0 K: H2 k. N8 T. s2 U

5 l' ~7 c( o2 ]3 [- C9 [" ~大侠，请仔细阅读FICOLL的说明书，上面有温度不能超过25度，不然影响离心效果。

hanwei0610

谢谢楼上的朋友，我有仔细看了下说明书。再此更正一下，确实不能预热Ficoll分离液，只要使用前放置于室温即可。
2 b0 L7 w6 a: z  I( j个人的经验有线，欢迎大家多提宝贵意见！谢谢！