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最近一直在提诱导体细胞为ips的四种质粒，前两次提的还好，但今天却出了一些问题，我们用的是QIAGENE的中抽试剂盒，简明说下步骤啊：集菌、P1重悬、P2裂解、P3中和、离心过柱、洗脱、异丙醇沉淀、离心后用70%的酒精洗涤、离心后倒掉上清蒸馏水溶解，无菌处理。基本过程就这些，但问题就出在用70%酒精洗涤这一步，加入异丙醇混合离心后能看到很明显的沉淀，但用70%酒精洗涤之后就看不到沉淀了，我们仍然坚持做到最后一步，检测的结果有一管没有质粒，其它3管含量都极低。
" v+ Q( }2 V% F, Y& J: G8 y5 Y+ j 以前用自己配的试剂大提时也出现过这样的情况，其操作步骤如下：2 o2 ]( r' p+ Z4 E+ D
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, \: \6 L: ~0 R- C0 g 质粒ＤＮＡ的大量制备
$ d% O1 d5 t6 b- V 1、集菌; K) L, u3 T+ s: p; u" N( u
２ 加入15—30ml用冰预冷的STE溶液，将细菌沉淀重悬，4度，6000rmp，10min。
R7 G& R+ H3 N) o 3、 去上清，加入6ml溶液1重悬沉淀，冰上放置20min。 4 A6 C, c) Z" C) F& H$ f: M' N
（溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部； EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去
# s4 G9 m' ^- ~. x 4、加12ml新配制的溶液Ⅱ，颠倒混匀，放置不得超过5min。溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1％SDS（可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离）盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
- v) S! u9 M; [* c 5、加9nl用冰预冷的溶液Ⅲ，颠倒混匀，冰上放置20min。$ a2 a! t$ X& [8 K
溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾 60ml，冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。5 K4 R4 \# G- O3 A- R& G
6、用6—8层纱布将上清过滤到另一干净的250ml离心瓶中。/7加18ml（0.6体积）的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟（可-20度过夜）。( |' }7 |( ]. G3 Z @
７、用合适转头于室温以10000转/分离心10分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。
+ {8 y" s9 D# Q9 E" O0 ` ８、小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。10000rpm，5min，4度或室温。5 }1 e# I) R6 X+ w3 d
9、去上清，干燥（倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。）用5ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀,转到50ml离心管中) n- W4 i4 g5 {
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10、质粒ＤＮＡ的纯化
0 l/ X: k( ~' a/ | （一）聚乙二醇沉淀法提取质粒ＤＮＡ
+ s6 b# v4 }) V) L: f4 H1 A+ M2 g １）在上述核酸溶液中加入等体积 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，冰上放置10min（会变混浊）。用合适转头于４℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
8 x# A* R& j1 R/ }3 q# `* X' u; i ２）将上清转移到另一50ml离心管内，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2,这一步越清说明质粒越纯），再加等量的异丙醇（变混浊），充分混匀，室温放置10min。! C+ p1 P) F, E0 O& u0 f. m
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３）室温以10 000转/分离心10分钟， 回收沉淀的核酸。4 ^( L5 Y/ B% J, @1 }- D
4)小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用10ml 70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，10000rpm,5min,室温离心。4 ]) S6 C4 |' Y
４）弃上清，干燥，加入1.5ml TE（pH8.0）溶解沉淀，每管加入3ul含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ），37度摇床上摇1h20min，200rpm。５）将溶液转到2个1.5ml EP管中，每管加750μ等体积的l含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分颠倒混合，冰浴10min，用微量离心机于４℃以10000g离心10分钟，以回收质粒ＤＮＡ。$ M L A& j: P) F4 b9 X* a3 I
６）吸出上清，干燥，各用750μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。37度溶解，摇床1h。3 _1 |6 y2 C$ Q* q
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7）分别用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（避光保存）各抽提（？）5次，氯仿：异戊醇（24：1）（避光保存）抽提一次，以去除残留酚，12000rpm，3min（室温颠倒混匀5～6次）7 C: O0 R2 M/ ^" }! |, f
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8）将上清（水相）分别转到另一新的1.5ml EP管中，加1/10体积3M NaAc（Ph5.2）和2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20度放置过夜或2-3h。（因为无论用哪种方法提取,沉淀DNA时总会加入高浓度的盐,加盐的目的是破坏能使蛋白质保持稳定的两个因素,使蛋白和DNA分离并沉淀下来.而此时盐的阳离子会与DNA结合形成DNA-阳离子盐溶于溶液中,再用无水乙醇可以将DNA-阳离子盐沉淀下来,）
" v% B1 _+ r7 J （回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会 导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉 淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的.）
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2 j$ u; ]# M+ t2 e b$ _ 9）于4℃以12 000g离心10分钟，以回收沉淀的质粒ＤＮＡ。# `2 E8 S# ~2 T7 |. d9 R/ d; S
10）吸去上清，加1ml 70% 乙醇洗涤，4℃以12 000g离心5分钟。
& ]& p% V4 O7 c *（因为无论用哪种方法提取,沉淀DNA时总会加入高浓度的盐,加盐的目的是破坏能使蛋白质保持稳定的两个因素,使蛋白和DNA分离并沉淀下来.而此时盐的阳离子会与DNA结合形成DNA-阳离子盐溶于溶液中,再用无水乙醇可以将DNA-阳离子盐沉淀下来,但这样一来,DNA中就含有较多的盐离子,这势必会影响下一步实验的进行,所以要用70%乙醇洗涤DNA沉淀(因为在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子却可溶),用无水乙醇则达不到这个目的!）11）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽以干燥。加入适量无菌水或TE溶解DNA(一般每管300ul，时间较久)" X/ R1 a; l+ O- J* t/ b
12）测浓度：用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE（pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260＝50μg质粒DNA/ml），然后将DNA贮于－20℃。% h1 |0 o0 k1 E8 f
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问题就出在第8步，用70%乙醇洗完后也出现质粒消失的情况？有人说在这一步我们用酒精将其悬得太开了，只要稍微洗一下就可以了，不需要重悬，不知道是不是这个原因，希望大家能指点一下。 |
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发表于 2011-1-10 23:08
发表于 2011-1-11 08:56
