请问克隆启动子的时候引物要不要加ATG呢？

whe022

求解惑，谢谢

千细胞

不知道你打算怎么做，说说我的理解" Y1 Z, _# d* x  Z& y
如果单纯的是构建载体，再通过转染的方法打进细胞做标记的话，一般可以不包括ATG的；
5 a+ i2 U+ m2 z6 `# r如果做重组的话，一般GFP的插入位点就在ATG前面，是否要ATG看你设计的同源臂的位置了
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千细胞

不知道你打算怎么做，说说我的理解. z5 [, c. C2 T2 I$ p$ F9 D5 o
如果单纯的是构建载体，再通过转染的方法打进细胞做标记的话，一般可以不包括ATG的；
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whe022

谢谢哦，我做标记，那可以不加，但是加了也没什么影响是吗？

jefferson

没太明白你问题的意思, 我的理解是你需要克隆一个启动子, 而在PCR扩增这段启动子序列时, 需不需要在这段启动子序列的上游或许下游加上ATG (因为你提到ATG是加在引物上的) ?* P+ p4 J' [, A9 Z( i/ f
: O; {* T0 P& z/ S9 K& ]
启动子序列和ATG是两个不同的功能单位, 启动子序列的作用是在转录时被RNA聚合酶识别, 进而在启动子区域形成转录起始复合物, 然后转录起始复合物开始以DNA序列为模板进行mRAN的转录,这个是大家都知道的. 因此启动子序列其实就是在转录时用于被RNA聚合酶识别的一段DNA序列, 其最核心的部分在真核生物中是称为TATA BOX和CAAT BOX的区域, 其中前者大概在-25-30bp处, 后者大概在-70--78bp处, 这两个区域是能够被RNA聚合酶识别的核心序列, 很多真核表达载体的说明书中序列部分也都会标示这个载体上启动子区的这两个功能区.6 t/ {+ D2 T0 P0 H" O

1 ~% ^9 r8 r0 U/ V( P而ATG是结构基因编码框的起始密码子, 当结构基因转录为mRNA后进入翻译水平, 43S的翻译起始复合物沿mRNA的5' UTR 区扫描, 一般遇到第一个ATG的时候, 和60S的核糖体大亚基在ATG位置组成成完整的核糖体, 然后沿mRNA开始翻译出氨基酸链来. 因此, ATG是在mRNA翻译时被核糖体识别的翻译起始密码子.
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因此, 启动子和ATG笼统的说都具有起始功能, 但其作用是完全不一样的, 一个是在转录水平, 一个是在翻译水平. 在启动子上游加ATG是完全没必要的, 因为启动子不需要翻译成蛋白质. 还有可能导致启动子的结构发生变化,从而降低其与RNA聚合酶的亲和力, 造成起始效率降低等. 如果你是想在启动子序列下游引入ATG以便有效的使下游基因得以表达,  那一般也是不可行的, 因为首先一般的结构基因都具有自身的ATG, 从而精确的控制翻译出来的蛋白序列, 其次如果你在启动子序列下游引入一个ATG后插入基因组, 这个ATG肯定位于结构基因自身ATG的上游, 如果位置控制不精确, 在启动子序列的作用下引入的ATG转录至mRNA上, 进而被核糖体识别开始翻译, 则下游的结构基因要么在蛋白的N端多了数个氨基酸, 从而可能影响到蛋白构象; 要么全部移码, 翻译出完全未知的蛋白.1 R! c% R; }5 f$ x1 S  i$ @# y3 X
& A8 M; c' _) u
不知道我对你的问题理解的对不对. 只想到了这两种可能, 解释的也都是基本概念, 不知道你是不是把这些搞混了, 或者完全不是我理解的意思.

whe022

好详细哦，明白啦，谢谢哎