求助：求流式细胞术鉴定细胞的具体操作步骤？

stefan

      由于要对培养的细胞进行表面抗原鉴定，要用到流式细胞术。虽然已经做了一段时间的细胞培养，但是由于以前没接触到流式细胞，对这个方面还是比较陌生，想要请教各位高手：进行流式细胞术的具体实验步骤是什么样的？如：做一次流式要用到得细胞数？做流式前要怎么处理细胞，还请高手指点？谢谢谢谢了！！

dove365cn

先了解一下流式细胞仪的原理吧,给你一分资料,你先看看9 F6 k( Z! h& N4 [
关于需要多少细胞量, 看你测的总的抗体素了,一般鉴定都做单染, 每个抗体按1×10的6次方计算, 再乘以抗体数就是所需的总细胞量. 比如你要做5个抗体,那就需要5×10的6次方个细胞.别忘了还需做阴性对照或同型对照.
0 D3 x3 E: T' U/ _1 j2 \0 _* X膜表面分子的标记还是很简单的.
3 [' r! x: Y& M细胞的处理,贴壁细胞需先胰酶消化至单个细胞, 然后单细胞悬液经PBS洗涤一次, 以除去血清\培养基等到物质; 然后标记抗体,一般为4度30分钟, 然后PBS洗涤一到两次,除去未结合的抗体; 此时便可以上流式细胞仪检测了.

cjhpumc

给你发一个我们实验室的protocol供参考" m' v! W( ~5 n& N# ~& I9 U0 v# Q
流式细胞术分析干细胞表型4 U/ {: O- |8 R7 {1 S( M& V+ @
1．        细胞经胰酶消化，1000rpm 10min,PBS洗2遍。
7 p' _$ `( v$ ~2 [2．        PBS重悬细胞，分装至EP(1ul/管)，2000转 6min 离心，弃上清，拍散细胞，加1ul抗体/管(塑料小瓶包装)，10ul抗体/管（大玻璃瓶包装）。注意：加完抗体的管子要马上盖盖，避免混淆。7 R, R. p% D) G
3．        4℃避光孵育30min,各管加1mlPBS, 2000转 6min 离心，重复2遍。
3 t( ]5 O+ Q5 {1 c0 t9 ?$ @% o/ x4．        最后加0.5mlPBS重悬，再用滤膜过滤除去细胞团以避免堵塞流式仪。$ M- U) x5 z9 W* O2 r4 ^
注意：要求细胞数量达每管1＊105细胞，根据细胞表型的数量决定所需细胞的数量。
' ~  G' l* v/ ]0 }

zxdlala

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4 h2 I( X! z% Z
) v* W1 K' a" S5 A( v你好，我想问下阴性对照和同型对照应该怎么设计呢？是不是再检测一个阴性标记？

sarah19860420

回复 cjhpumc 的帖子$ ~6 o. \: ~/ ^! e9 E  f% r5 S

5 W7 P: ?0 c. y3 y8 ~0 Z( u; ^# C您好，我想确认下您的意思是每种细胞每种抗体需要的细胞数是10*5，对吗。我看BD的protocol上说的是每种抗体需要的是10*6，到底哪个对呢。您帮忙看下，谢谢。

sarah19860420

回复 dove365cn 的帖子# ~: o- L% G+ h; V5 a7 H

+ n8 |; A: H4 u; ?( ^您好，我想确认下您的意思是每种细胞每种抗体需要的细胞数是10*6，对吗。但是楼下的又说是1*105，到底哪个对呢。实话说细胞确实也不多，而且需要做的抗体数是9个加上1个阴性对照，如果按照您说的细胞数目需要10*7个细胞了。请帮我确认下，谢谢

mengnancy

一个检测管，需要1*10^6个细胞，可以做双染或者三染，可以节省细胞。

zhangy259

请问 抗体 在哪家买 会好些？

123jiaoyue

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" ?3 Y. `3 t# S  q4 j+ O7 T- W5 C( |& d% Y1 ]1 t9 B5 a
BD公司有做干细胞鉴定的试剂盒，效果不错 就是价格有点高
* _3 l1 a5 R# g9 j& ^7 xBD的抗体 abcam 的抗体都还不错 进口的抗体浓度高一些，国产的就不一定的

123jiaoyue

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# |0 B( z* r% D* ~* v* d; C2 m: D, d. @  ?* I' m
我想知道设门怎么设啊 - p- c: s2 X9 d, Q6 ?9 q
设不好 峰也有问题