关于Mef细胞原代培养的问题

liufutang

从老鼠胚胎培养mef细胞做IPS的支持细胞，按照Protocal上面的流程操作，为什么传代第一次后很多细胞便死亡了呢(贴壁不好)？ 培养基10%DMEM,也尝试过20%DMEM,（胎牛血清）但是结果没有什么差别。一只胚胎培养于10cm直径的培养板中，或者3只胚胎培养于75T的培养瓶中。请教各位，您觉得有可能出现问题的地方，望不吝赐教。感激ing...

懵懂干细胞

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5 V' V/ ~4 s% @* P- b0 pMEF细胞制备的过程中肯定不是100%纯的，相信阁下在原代制备过程中离心收集的时候注意到了离心沉淀是红色的，这说明里面有血红细胞，当然肯定也还有脂肪细胞，一定量的内脏细胞等等，MEF真正站的比例有可能不是很大，这样在第一次传代之前阁下应该仔细观察并在细胞贴壁后换液，漂浮起来的杂细胞和死细胞会被去除掉很多，如果没换液就进行传代的话，那贴壁不好是必然的，即使换液了也不可能把杂细胞全部去除，所以还会有少许的杂细胞和死细胞，相信阁下的MEF细胞会在阁下精心培养下越来越纯的！4 z, x  E  L# z7 U! V
祝你好运！

liufutang

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4 L( {# z3 C5 t/ Z. G8 X/ L& i. N2 x' K4 B- [) |5 r
感谢版主点评，我按照的建议尝试一下~ 谢谢加分鼓励！ 呵呵 我想再请教一下 我用的是国产的胰酶，可能是这个产品毒性导致的么？

懵懂干细胞

国产胰酶我没用过，其作用原理跟你分享一下如下：细胞外含有多种胞外蛋白，如胶原蛋白；另外细胞与细胞之间也有很多信号通道等等连接的通路，主要成分是糖蛋白，使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来。用胰蛋白酶分解这些蛋白质后就可以使它们分开了！4 `+ S4 Q; S, Z+ X$ g( D, `  L' F# q
胰蛋白酶能够催化蛋白质的特定肽键水解，这个催化过程是不需要能量的，不会使酶失去活力，也不会改变形状和使自身水解。7 n+ ~# [3 G0 g3 V* T% [
底物与酶的活性中心的结合是可逆的，这种结合使得蛋白质特定肽键因弯曲变形而被活化，更易于受到水分子的攻击，分别形成氨基和羧基而断裂，得到小分子多肽或氨基酸。
9 l: x, Y9 u& H3 f/ m5 y不同的蛋白酶可以作用在不同氨基酸相连组成的肽键，因此胰蛋白酶并不能作用在所有的肽键。 ; Z+ `) {! X6 l4 S
血清终止的原理其实是竞争抑制。就是用过量的牛血清中含有的蛋白来和胰酶结合。不给胰酶消化细胞蛋白的机会，% [( y, k* _$ L
所以我认为一般只要血清存在量有竞争优势情况下，胰酶的毒性应该可以忽略，具体应该也会对细胞状态有一点影响吧！
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懵懂干细胞

国产胰酶我没用过，其作用原理跟你分享一下如下：细胞外含有多种胞外蛋白，如胶原蛋白；另外细胞与细胞之间也有很多信号通道等等连接的通路，主要成分是糖蛋白，使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来。用胰蛋白酶分解这些蛋白质后就可以使它们分开了！% e4 M, c5 R$ M. Z: Y
胰蛋白酶能够催化蛋白质的特定肽键水解，这个催化过程是不需要能量的，不会使酶失去活力，也不会改变形状和使自身水解。
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不同的蛋白酶可以作用在不同氨基酸相连组成的肽键，因此胰蛋白酶并不能作用在所有的肽键。
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所以我认为一般只要血清存在量有竞争优势情况下，胰酶的毒性应该可以忽略，具体应该也会对细胞状态有一点影响吧！
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liufutang

感谢版主不吝时间精力赐教！真是学到了不少~ 十分感谢！

nculsa747

回复 liufutang 的帖子* l% z" J$ v/ E
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首先，国产胰酶是没有问题的。其次，10%FBS即可。传代后有大量细胞死亡，只可能是你消化的时间太长了。你的消化时间控制在1-3min就可以了。祝好运！

liufutang

回复 nculsa747 的帖子, Q- l2 v$ j  Z% D+ u" i
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谢谢啦~~ god bless you and me ~ thanx again

nculsa747

回复 liufutang 的帖子5 I& h, t7 n# h7 T* G0 Z" Y

5 R) c1 ]4 F/ b2 q: h# g5 J2 p好吧，我再告诉你一个问题，做原代时，平均三个胚胎的躯干放一个100mm平皿即可。一只孕鼠通常做三盘P0代细胞，以后按1:3隔天传代。