求救 神经干细胞突然就不成球了

2008xiao

        养了两个月的神干，一切顺利。最近突然就养不出来了，新分离了几个批次的都不成球，培养条件，试剂和以前都是一样的：DMEM/F12 （买的gibco的液体的）  20ng bFGF   20ng EGF  B27  14-16天胎鼠皮层。 没有观察到染菌现象，培养箱也没问题 别人的细胞长的好好的。分离时直接吹打的，自己拉的玻璃管，火焰抛光，接种前苔盼蓝染色，死细胞不多，两成的样子。接种后一周不见成球也不见增殖。$ L: c9 L* }. w1 c) T
    拜托哪位大侠指点下，会在哪里出的问题？ 苦思冥想也找不到问题所在，浪费了钱和精力，老板很给力（压力）。

xfyang2007123

能发张照片看看嘛？看你是直接吹打的，不会是吹打过头了吧？我觉的还是组织块法较安全！
8 t2 a% g; n6 w* K3 H9 P

2008xiao

回复 xfyang2007123 的帖子6 L7 `/ Q# F! P

8 ]% u$ ?- m5 B6 ?4 _照片没拍，明天去拍，呈单个细胞，贴壁，没出现分化迹象。我一直用的直接吹打的方法，两个月都没出问题，最近吹打时越来越小心，50次的样子就停下了（以前100次），剩下的组织块就不要了。你说的对，很可能问题就出在吹打上面，下次我用accutase消化加吹打试试。
! S. B8 f4 ]% y' M8 Z; G你说的组织块法是什么方法？我是新手，没看到过这个方法，能给篇文献吗，贴个标题也行，多谢了！祝一切顺利！

碧海丹心石

我也是用的直接吹打法，用的是1ml的枪头吹打50次的样子，也成球了的。你培养基里面补加谷氨酰胺没有？那个容易降解，要两周补加一次

2008xiao

回复 碧海丹心石 的帖子
2 C; M* r$ b' N/ B; I" c, z/ I- o
% z# _. C- ]# l# \8 u谷氨酰胺补加了，情况没有改善，谢了！祝顺利！

2008xiao

这两天我又分离了一批，还是不成球，同样的方法曾经养的很好的，两个月都没问题。真是郁闷啊！- t8 p& T; n) {. x9 ]3 ?  P
但是，我用neuralbasal +B27，没有加生长因子，感觉效果挺好，20小时就成球了，增殖得很快。可是一般的方法是用DMEM/F12作为基础培养基的，而且我也曾经用这个养的很顺利，难道是我的DMEM/F12有问题？我买的是液体的，应该不会出什么问题的啊！哪位老师能指点下呢？先谢过了

禁林秋木

要么是你的标本新鲜程度有问题，要么就是你消化太过度了

dingyx2009

我最近也出现这样的问题，也是以前养的很好，一直用gibco的现成液体，这次新买了一瓶，细胞也很难聚球，有人也给我提出是DF12的问题。高度怀疑，正在排除中。祝顺利

dingyx2009

我拿同学的DF12再次培养神经干细胞，别的条件都没有变，神经球长的很好，今天终于证实就是DF12培养基的问题。建议你也逐步的排除一下。