多潜能干细胞基因谱鉴定与成瘤性体内示踪

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% N0 V- ]( [$ ?. D1 L干细胞用于细胞治疗的质量控制环节很多，甚至包括产品运输存储等物流程序的影响。而从技术角度而言，从源头上控制干细胞的基本基因结构稳定完整，以及移植后追踪和处理体内命运，可以看作是多潜能干细胞临床应用的第一道与最后一道防线。英国皇家学会杂志一期中有两篇相关review文章，正好借来译述一下，加一些评论。其中源头检测的文章是着重临床治疗级别胚胎干细胞的，不过对研究以及其他干细胞也有借鉴意义。另一篇体示踪主要用的是成瘤性为例，同样对其他干细胞体内命运也有应用前景（见文后附件）。未必是成系统的图景，更多是一个可参考框架。% y+ |  \3 A2 h* s0 h2 B8 I

- _- L9 f( _& D" h+ P一、源头检测# r/ q3 A# J4 [0 X* |
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多潜能干细胞的本质是它能不断自我更新同时保有分化为各种细胞的能力，其应用价值还体现在体外大规模增殖和分化可能。而细胞增殖和分化本身以及所需要的条件必然伴随基因的复制，有复制则难免出错，基因出错的后果将会给临床应用带来很多风险，包括肿瘤。而且，多潜能干细胞治疗有可能导致某种或几种缺陷传播给大量的人群的风险大增。因此，单从质量与安全角度来说，保证多潜能干细胞基因谱的稳定与完整，是再生医学临床应用的第一道防线，也是一个基本要求。在这个基础上，才能谈得上分化产品的质量稳定性和体内应用的安全有效性。多潜能干细胞的标准是胚胎干细胞，iPSC从某种意义上是模拟胚胎干细胞的状态。因此，多潜能干细胞的基因谱质量检验与控制，可以胚胎干细胞为基准。
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# h; k3 k, b( j0 `" _可能影响胚胎干细胞基因谱质量的因素，可分为内因和外因两个层面。- o8 a' m  t+ `1 A/ \
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内因。胚胎干细胞来源即胚胎本身的质量，属于内源性基因异常。如50%以上植入前胚胎有染色体异常；不孕不育有可能是尚无法诊断的基因变异引起的；寻求辅助生殖或基因诊断患者群的均衡结构性染色体异常率高于普通人群等。因此，由这一人群得来的胚胎干细胞有可能继承了这些异常。# n" d; i- _* w9 I- Q

8 p& W# H: |* F) ]外因。即体外培养方法和条件的可能影响。细胞在体外的变异率应该高于体内的自然变异率，或者说体外DNA复制的准确率要低于体内正常细胞的准确率。主要为LOH（loss of heterozygosity），其中的一半以上是UPD（uniparental disomy)。体外条件和操作技术可以影响胚胎以及胚胎干细胞的基因表达类型和基因谱完整性。如汤普森实验室的H1和H14胚胎干细胞系多了一条12号染色体，而英国谢菲尔德实验室的同样细胞系多了一条17号染色体。而且胚胎干细胞未必能很好地抗ROS和Free radicals对DNAde损害。胚胎干的抗氧化酶类水平低。
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$ h( {; N8 X* n7 J采用酶分解细胞克隆的负面影响。对细胞接触和极化的干扰可以导致核型的重组和DNA损害，而且胚胎干细胞尚未获得胚胎在体内所拥有的对上述风险的保护机制。p53在胚胎干细胞中的作用也不同于其正常的导致变异细胞的凋亡等功能。而手动分解细胞克隆也有风险，且难以保证恒定性。Feeder free培养条件因其结构性也会影响细胞间的接触等，有研究发现二维材料有不利影响，而三维生物源材料相对有利。
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冷冻保存与解冻过程的影响。常用冷冻液会改变细胞表观遗传并产生radicals，从而影响DNA复制和组蛋白结构。解冻过程产生的冰结晶和气泡有可能干扰细胞纺锤体从而导致染色体的非正常分离。斑马鱼结果提示低温冷冻保存会提高线粒体基因谱的变异率5倍之多。$ P$ R. D6 E5 R- U- z
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传统的核型分析手段无法检测亚微观分子水平的变化，因此需要新的技术平台，如Array CGH用于分析CNV（copy number variations)。已经有网络共享数据库，用于与正常人群发生率，病理相关与非病理相关（位置意义）方面的比较。不同传代阶段的比较，可以检测多潜能干细胞培养方法和条件对CNV的影响，同时也可以检测较大尺度的染色体失衡。: J5 f" v, S4 A% G% j% ^
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另一个新技术平台是SNP(Single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性)genotyping。一个潜在的用途是检测人种背景多样性，对临床药物筛选具有意义。尚未用于胚胎干细胞鉴定。SNP分析还可用于检测UPD，一种LOH，所谓单亲异二体和单亲二体型，这些变异可以导致一些特定的遗传疾病，但还很少用于胚胎干细胞系的检验。7 q; V+ a" U# A

9 @  C0 a% n7 P! x) _8 F" y某些胚胎干细胞系相对于其他胚胎干细胞系更易于体外传代，因此被选用作研究的情况比较多。然而，易于传代对于维持基因谱系的完整性而言未必是好事。某些遗传变异可能提供选择性的传代优势。( A3 P) U  Y* H: l7 e( v
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对这些广泛使用的易于传代干细胞系的高分辨CGH显示，这些“正常”的干细胞系存在基因剪除和重复，也有染色体异常的报道。比较上述干细胞系早期和后期传代发现百分之24的LOH和百分之66的CNV发生变异。
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, m2 c0 g9 _7 F以上情况提示，亚微观水平的Array CGH检测染色体异常及CNVs应该成为所有多潜能干细胞系的质量标准，作为新干细胞系进入大规模干细胞库之前的强制性诊断手段。而SNP检测技术则作为一个辅助平台用于鉴定人种差异和全基因谱LOH。' \* l. Z- M: G" ~# ?
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从实际的操作层面来看，这些新技术本身价格仍比较贵，但随着市场的扩展应该有比较大的下降，以便建立服务于广泛市场范围的中心检验机构，或某些有条件的实验室和临床机构。另一个要考虑的因素是科学研究目的的和临床应用目的的干细胞系和干细胞库使用这些新技术检测完整基因谱信息的必要性。
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+ B4 [/ Y" L5 y1 B( O3 E这个从干细胞来源“预防”基因变异或保证基因信息完整的策略，也同样适用于其他的潜在干细胞产品以及其他干细胞特征。如经过比较大的体外操作的成体干细胞（如生育相关组织干细胞、骨髓造血干细胞、间充质干细胞等），甚至经过体外加工的自体多潜能干细胞如iPSC及其分化产品，理论上也需要对内源性及外源性因素导致的基因变异进行强制检测。而且，表观遗传特性也越来越成为一个重要的指标。
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' e+ @5 |) ]# e9 G" V7 z! j这个多潜能干细胞源头的亚微观全基因谱系检测，也将是干细胞产品研发、大规模制备和产业化投资的一个必要保障。从再生医学产业化的角度而言，对这方面技术和服务体系建立的投入将是不可或缺的。当然模式可以是多种多样的，包括国家级或区域性综合干细胞库自备检测体系，大的研究机构设立公开平台用于科研级的鉴定，临床相关机构建立面向临床的基因检测中心为干细胞检测提供服务（如人工辅助生殖临床已有相关的技术用于临床，以及独立的基因诊断机构提供相关服务），也可以有独立的商业化检测中心。从研发、临床和市场化产业链来看，人工辅助生殖临床——基因诊断中心——干细胞再生医学研发相结合的体系，将非常有利于干细胞产品转化研究。* M3 M3 T  b* \9 |
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" Q1 p. ]% b) ~( Q5 R$ C; O二、植入“追踪”$ E0 d1 I' s: T1 Z2 {
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干细胞来源上的体外检验只是第一道防线，抛开产业化scale-up的运作过程的可能影响，多潜能干细胞本身及其分化的终极产品进入体内后的命运及其可能的作用（副作用）也需要加以实时的追踪以及相应问题的处理。解决这个问题的思路是对进入体内的多潜能干细胞产品进行体外示踪。这方面的工作主要是从成瘤性的角度来开展的。
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* h, [8 s* C2 W9 i0 _5 ^. T' `首先，看看多潜能（pluripotency）与成瘤性（tumorigenicity）之间的联系。; B& `- z1 T9 {( s

2 q0 y5 p7 ?# e: k7 P  }多潜能性最早就是在恶性畸胎瘤中发现的。胚胎瘤细胞（EC）具有自我更新能力并能分化为各种组织。单EC细胞移植可以导致具有各种组织成分的恶性畸胎瘤发生。而正常的小鼠胚胎或胚胎脊移植也可以导致畸胎瘤，说明正常胚胎中也有肿瘤发生细胞。而从胚胎获的人胚胎干细胞具有与EC细胞相同的多潜能因子（e.g. SSEA3, SSEA4, TRA 1–60, TRA 1–81, telomerase and alkaline phosphatase)，而且也可以形成畸胎瘤。与EC细胞类似，胚胎干细胞存在有利于自我更新和限制分化的基因变异。其中增加一条12号染色体，而这条染色体异常与人体睾丸生殖细胞瘤有关。重要的多潜能因子Nanog也存在于这条染色体上。研究还发现多达330个基因在胚胎干细胞、EC以及精原细胞瘤之间共表达，这其中包括POU5F1即Oct4。" Q* n7 H8 ~/ x: D
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通过checkpoint-凋亡来保持基因完整性的复合机制在多潜能胚胎干细胞是分离的，从而增加了在快速增殖情况下成瘤的风险。
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基因表达的分析表明，一些iPSCs重编程采用的多潜能因子本身具有致癌性，如c-Myc and Klf4，获参与肿瘤发生过程，如Sox2, Nanog以及Oct3/4。这些因子已被发现参与乳腺癌、口腔癌、前列腺癌等。而且含有这些多潜能基因的肿瘤细胞在动物模型上表现出增强的成瘤性。Oct4过表达可诱发上皮组织可逆性发育不良，也证明Oct4与成瘤性的关系。
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' W2 [: t, s3 u& S多潜能性与成瘤性之间生物学联系的最佳证据来自c-Myc。c-Myc可以提高Oct4，Sox2和Klf4的重编程效力，阻止分化和促进增殖。Myc调控大量的基因，绝大部分与细胞增长有关，并被证明参与肿瘤过程。（L-Myc例外）。9 i. d  T4 y& ]; S7 h7 \: n/ h
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最近发现21个基因在人胚胎干细胞和畸胎瘤中共同高表达，其中促进细胞周期循环，阻止凋亡，参与signal transduction, transcription or translation者被命名为已知致癌基因。其中最突出的是Survivin，一种抗凋亡基因，同时参与细胞分裂调控，这一基因在大多数癌症中均有表达。Survivin在胚胎干细胞和畸胎瘤中也呈高表达，而在成熟的EBs中表达降低。
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1 Q, G8 N6 ]/ ~2 e: P8 E5 l% k由此可以说明，肿瘤形成并不依赖EC样细胞的存在而是取决于多潜能细胞的内在特性。而且，多潜能细胞的成瘤性随着细胞分化而降低。如此一来，研究者们便面对一个两难处境，即降低干细胞成瘤性的同时，也将消弱干细胞最具吸引力的潜能——自我更新和多潜能性。& t/ r, e( P& M& w( H! B* e

. ]' B* h! x3 ]: n; V1 u# R既然多潜能干细胞内在的特质决定了其成瘤性的存在，那么多潜能干细胞及其分化产品在体内的命运就需要通过分子水平的细胞命运示踪技术来跟踪监测，并在必要的情况下处理发生的问题。
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目前采用的两种策略，即直接标记法和报道基因（reporter gene）整合法。9 G: r( E, L4 o0 w

! G) ?# y9 n7 I9 q直接标记法包括纳米粒子标记法，铁磁粒子标记法，放射性核素标记法等，检测手段包括MRI，SPECT, PET和gamma camera imaging等。这些标记技术在细胞标记的特异性，与细胞成分整合性，半衰期等方面各有优劣。
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报道基因整合法。某个报道基因连接到promotor或enhancer上，转录为mRNAs，然后产生报道基因蛋白，这种蛋白将与外源性报道基因探子发生互动反应，产生信号，从而由体外CCD camera, SPECT, PET or MRI等手段检测。报道基因可以是细胞内酶，细胞表面报道基因，细胞膜间蛋白，或细胞内积聚（与内源性元素相互作用发生信号）等模式。各种报道基因整合于靶细胞的染色体，可以从母细胞传给子代细胞，因此可用于真正追踪检测细胞的生存与增殖。然而基因插入带有一定风险，尽管尚无动物实验的副作用报道。+ C5 d' ]! H, B% ]7 |) Y& Q

! E7 ?5 P! r  b' L对多能干细胞及其衍生物在体内分子水平的追踪，首先可用于早期发现任何可能的成瘤倾向。已经有一些小动物模型检测多能干细胞（胚胎干细胞）移植后肿瘤形成的过程，以便建立各种示踪方法的效用。初步前临床研究结果为胚胎干细胞移植数量的效应、畸胎瘤形成的局部微环境和动态过程提供了一些数据基础。% z2 _3 R' H6 F% S' X
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报道基因示踪技术的另一个用途，是采用自杀基因技术，在发现移植的多能干细胞形成肿瘤时消除肿瘤。初步结果也提示由于各种技术有各自的优劣，在特定的临床目的下，可以采用多种模式结合来获得所需要的效果。& I) t2 h! {; l  ~

  M$ F2 }& w4 q未来要解决的问题首先是消除基因整合的风险，比如可以采用基因谱特定位置整合入zinc finger nuclease，或能够找到方法直接检测肿瘤细胞表面标记物或干细胞导致的肿瘤表面受体等。
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总体的目标是无副作用的标记检测移植细胞功能，长期高敏感高分辨率追踪，发现肿瘤风险时消除移植的干细胞或形成的早期肿瘤细胞。
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目前对多潜能性和成瘤性关系的理解以及体内示踪技术还在发展过程中，尤其是大多数研究还只是小动物阶段的前临床概念验证。但这种检测对未来干细胞临床应用将是必不可少的有机组成部分。示踪技术的发展和应用，也会反过来促进干细胞的研究。
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. c" t( E) ~$ E8 B" G技术层面的研究和考虑之外，上述干细胞检测与追踪技术的应用还需要克服一些现存的运作性障碍。如成本与效益的关系，技术平台的运作模式，标准与规则的建立（包括检测结果的意义的解读、相关处理机制（细胞系与移植问题）的决定等）。+ s, e; S- N) p8 W4 N: s
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干细胞再生医学是一个前所未有的多领域多角度社会工程，单单从上述干细胞质量检测和应用效果跟踪的例子来看，此言不虚。 . n2 G& r+ D( n) w- ^

1 ~( U' X! [* T3 r- e英国皇家学会杂志2010年第7期，方便起见一起附上。其中两篇有关的分别是：
, H$ ^" ]3 S2 R- aSafety paradigm: genetic evaluation of therapeutic grade human embryonic stem cells  H8 v! A, r# g+ D, m1 {
Tumorigenicity of pluripotent stem cells: biological insights from molecular imaging0 K+ F/ @8 d5 t, Q; S9 L# |

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mnxn

thank you very much.

haoxinaok

好东西！！！！

hyde

谢谢

gact

这样的话，，就能看看那些ipsc去哪里了。。。在体内能干什么。。

fengxuechunyang

报道基因整合法。某个报道基因连接到promotor或enhancer上，转录为mRNAs，然后产生报道基因蛋白，这种蛋白将与外源性报道基因探子发生互动反应，产生信号，从而由体外CCD camera, SPECT, PET or MRI等手段检测。报道基因可以是细胞内酶，细胞表面报道基因，细胞膜间蛋白，或细胞内积聚（与内源性元素相互作用发生信号）等模式。各种报道基因整合于靶细胞的染色体，可以从母细胞传给子代细胞，因此可用于真正追踪检测细胞的生存与增殖。然而基因插入带有一定风险，尽管尚无动物实验的副作. d# b. X( Q% C
非常好的文章，谢谢分享！
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