怎样设计原位杂交的探针 - 实验室综合讨论区干细胞之家



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runsong

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楼主

发表于 2011-3-25 20:30 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

68包包

想设计一段已知序列的mRNA的原位杂交探针，但本人从未做过这个，不知用什么工具、什么方法、按照什么原则设计。
望各位前辈不吝赐教。3 j# r: s" V& U1 Z6 a( B
序列如下) }: E% M+ O4 L
GAGATGAAACTTGTCCTCGGGTTTTTTTGAGTTGCAGACAGCCAGCGAGGTACTGGGGCTAGATGTGCCTGGAGCTTCACTTTTGTCCAGGAAACTTGCCACATCGAAGGCTTCTTCAAAAAGGATCTCCTCAGGGGTGGAGATCAGCGAGCAGCTGGCCCCCTGGCTGTCAACCCCGCTGTCCTTCACGCTGCCCTCGGGGCAGGCCGGCTCTGGACAGGACCCCACGAGGCCCTTCTGTGTCCGCTCCAAGGCCTGCAAGATGAAGGTCTTCCTCTCCTCCGAGAAGGTCTGCCACAGATGGGAGATG

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这个可以有很多种方法：最简单的是用寡核苷酸探针，从上面序列中选20-30个核苷酸的一段序列，上NCBI网站用Blast比对一下，看看特异性如何，选特异性最好的，用同位素或非同位素的方法标记，标记的方法可以参考相关的实验手册上寡核苷酸探针标记方法，可以标5'端也可标3'端（同位素），也可用生物素或地高辛标3'-端，你买试剂盒子比较方便，杂交时如果探针的Tm值太高可以加甲酰胺降低杂交温度。或者你也可以设计一对PCR引物（产物长 ...

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amigel

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沙发

发表于 2011-3-25 20:30 |只看该作者

这个可以有很多种方法：最简单的是用寡核苷酸探针，从上面序列中选20-30个核苷酸的一段序列，上NCBI网站用Blast比对一下，看看特异性如何，选特异性最好的，用同位素或非同位素的方法标记，标记的方法可以参考相关的实验手册上寡核苷酸探针标记方法，可以标5'端也可标3'端（同位素），也可用生物素或地高辛标3'-端，你买试剂盒子比较方便，杂交时如果探针的Tm值太高可以加甲酰胺降低杂交温度。或者你也可以设计一对PCR引物（产物长度在200bp左右，当然也要考虑特异性），将来自上面序列的cDNA进行扩增，在扩增的同时用同位素或非同位素闻标记，或者对扩增产物进行标记也可以。