转贴：PNAS:科学家发现肿瘤干细胞的一种新来源

tpwang

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. U1 K% T6 ^  x( S' [6 G0 k5 L0 W; j2 l
哪位朋友能提供一下原文：http://www.pnas.org/content/early/2011/04/14/1102454108.abstract: D6 I  w- U5 T8 t2 W

" @* a2 O, L3 ?- CNormal and neoplastic nonstem cells can spontaneously convert to a stem-like state
6 m" U8 [. U  f# D9 W9 I( uChristine L. Chaffera,b, Ines Brueckmanna, Christina Scheela,b, Alicia J. Kaestlia, Paul A. Wigginsa, Leonardo O. Rodriguesa,b, Mary Brooksa,b, Ferenc Reinhardta,b, Ying Suc, Kornelia Polyakc, Lisa M. Arendtd,e, Charlotte Kuperwasserd,e, Brian Bieriea,b, and Robert A. Weinberga,b,f,1
8 A! |! i. I9 f! m+ Author Affiliations; ]6 K/ g8 _4 o4 {3 C: W4 E
7 O5 s3 u' Q( b. W  o) z( ?- t) k
aWhitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA 02142; . J! n" }" |; X. y  N2 J
bLudwig MIT Center for Molecular Oncology, Cambridge, MA 02139; % L& a9 F- m5 O* ^. c
cDepartment of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA 02115;
% ~8 e# q+ k9 ]; i; ~dDepartment of Anatomy and Cellular Biology, Sackler School, Tufts University School of Medicine, Boston, MA 02111; # U  ?9 U4 o8 B' k. M5 D6 B
eMolecular Oncology Research Institute, Tufts Medical Center, Boston, MA 02111; and 4 g1 H9 b( W1 W: h# n3 D
fDepartment of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139
7 w! C9 k( ?3 s! O& Z2 bContributed by Robert A. Weinberg, March 2, 2011 (sent for review December 8, 2010)
5 T8 p# Y9 n1 J. u$ e+ D; S# E5 b) Y/ w- N9 F$ z* B, [' j
•The authors declare no conflict of interest.4 I6 [4 }% z) T4 ?( u# M; c" U/ Q3 F

4 d7 |: R. |+ l2 z; Z* M- f6 YAbstract
; V2 y/ z  Z/ p( \0 M) b/ @( o- r2 g" YCurrent models of stem cell biology assume that normal and neoplastic stem cells reside at the apices of hierarchies and differentiate into nonstem progeny in a unidirectional manner. Here we identify a subpopulation of basal-like human mammary epithelial cells that departs from that assumption, spontaneously dedifferentiating into stem-like cells. Moreover, oncogenic transformation enhances the spontaneous conversion, so that nonstem cancer cells give rise to cancer stem cell (CSC)-like cells in vitro and in vivo. We further show that the differentiation state of normal cells-of-origin is a strong determinant of posttransformation behavior. These findings demonstrate that normal and CSC-like cells can arise de novo from more differentiated cell types and that hierarchical models of mammary stem cell biology should encompass bidirectional interconversions between stem and nonstem compartments. The observed plasticity may allow derivation of patient-specific adult stem cells without genetic manipulation and holds important implications for therapeutic strategies to eradicate cancer. $ f3 y! l" z0 N' |3 G1 D0 V
" w1 I) @% u0 \
（简译）8 h! s% x5 q+ Y8 S8 G* V- d/ V8 i( }
流行的干细胞生物学理论认为，正常干细胞以及肿瘤干细胞位于细胞层阶的最顶端，单向分化为非干细胞的子代细胞。与这个假说相反，我们在乳腺上皮细胞中找到一种基底样细胞亚群，他们可以自发地去分化而成为类干细胞。我们并且发现，组织癌变可以增强这种细胞自发转化，即非干肿瘤细胞可以在体内及体外产生类肿瘤干细胞。我们进一步揭示出，正常来源细胞所处的分化状态在很大程度上决定了转化后细胞的行为方式。这些发现表明，正常干细胞以及肿瘤干细胞可以反过来由高度分化的细胞所产生，因此现有的乳腺干细胞生物学层阶模式需要修订，以整合这种干细胞与非干细胞之间双向转化现象。所观察到的这些细胞可塑性可能有助于不用基因改造而获得患者特异性成体干细胞，而且对彻底清除癌细胞具有重要的意义。
& J. R8 z! l: T. G
5 h& \4 k' V2 E8 W3 C（如果这个现象在其它肿瘤中，在其它病理状态和组织中，甚至在非病理状态中得到验证，将对体内直接转分化研究甚至细胞的生物可塑性有很大推动。不过，很多干细胞现象的一个普遍问题是“幅度”（scale），即这些现象是否具有足够大的“规模”，可以产生明显的生理和病理效应。iPSC甚至胚胎干的体外效率仍旧很低，成体干的很多现象也大多处在“概念证明”阶段。退一步说，即使体内没有足够大的自然过程，如果能够方便地在体外人为“放大”这个过程，达到实用的地步，也可以反过来证明可塑性的存在，尽管是“虚拟”的存在。这大概是最难的。另一个相关的理论和实践问题是这些体内体外的“可塑性”的本质是什么，残留？病态？拟或是人们希望的正常生理状态。）

shen_coco

刚拜读了一下这篇文章，确实有点意思

tpwang

, S, |* m  l& L- R- @6 j. u2 b$ v

* j, p5 l1 u: y$ U  U6 |, m回复 tpwang 的帖子
2 |. m! B) M# C2 ~, q5 i
' }: {2 W4 z* d3 _' @0 lNormal and neoplastic nonstem cells can spontaneously convert to a stem-like state, I$ d; }/ T) e
非干细胞的正常细胞与肿瘤细胞可以自发转化为干细胞样状态
5 }% e5 _. o8 {( T! F& B6 Y. b  O; T9 |" {' S
（Whitehead Institute and MIT的Robert A. Weinberg实验室的一个新研究，与EMT也有点关系，也够颠覆的。）
3 J. ]2 i! R; D) \' q5 y8 I0 r5 |# {  _# e7 D5 e& E$ v6 `* B
新闻都标榜为发现了一种“新的癌症干细胞”，其实，这篇研究首先是要证明正常乳腺上皮细胞中存在一种细胞亚群，具有转化为类干细胞的能力，然后在乳腺肿瘤上皮细胞中验证了这个亚群及其转化现象的存在。虽然说同一个现象在正常组织和肿瘤组织中平行表现出来，给人以正常现象有可能出错而导致肿瘤的印象，而且可能作者最终是想证明癌症干细胞可以由非干癌症细胞转化而来，不过从研究本身来说，是分两大部分，而且方法的建立是由正常组织来的。新闻直接说“发现一种新的癌症干细胞”，有点掩盖了非干细胞转化为干细胞这个核心结果。
- X& f& S" n" T0 F! D8 p4 u1 t
/ h+ q6 @% @3 `" C; H干细胞单向分化为各种程度的成熟细胞的模型尚未在正常和癌变乳腺中得到确证，同时也发现正常或肿瘤上皮细胞在培养条件下具有干细胞样特性。因此，该研究者试图从乳腺上皮细胞中分离出具有干细胞特性或分化细胞特性不同的亚细胞群，然后“意外”（unexpected）发现某些成熟分化细胞亚群具有转化为类干细胞的能力，然后又在乳腺肿瘤组织中验证了这一现象。' q: D( Q' u5 s5 q+ k! y: M: A
- j: L4 l6 ?$ ^
过程也颇有趣。先是发现培养的上皮细胞中有一小群漂浮的细胞，离心分离出来，直接命名为“人上皮漂浮细胞”（HME-flopcs = human mammary epithelial floating populations of cells），然后放入新培养皿中，获得贴壁细胞。非漂浮和漂浮上皮细胞群特性基本相同，但在平面培养条件下漂浮细胞不形成典型的单层上皮层。然后用CD44、CD24、ESA作为标记，飘浮与不漂浮作为对比细胞群，区分出了三种亚细胞群，其中漂浮上皮CD44hiCD24loESA-亚群表现出类似于乳腺干细胞和前体细胞的标记谱，而飘浮上皮CD44lo细胞更类似分化上皮细胞。
" s$ g4 g! \0 {+ l0 g: q, Y, t9 A
% V, G  n. B2 T! I然后通过一系列挺巧的实验，证明漂浮上皮CD44lo细胞可以自行转化为CD44hi细胞，也就是说分化的细胞可以逆分化为干细胞样细胞。然后用mammosphere成形实验来检验各亚细胞群，发现具有干细胞特点的漂浮上皮CD44hi亚群形成mammosphere的比率最高，包括原来存在的和后来转化来的CD44hi亚群，表明分化的细胞转化为干细胞样细胞后能够形成mammosphere，也就是说具有干细胞的功能。
3 E2 Q+ k: `+ ~" Q3 l7 w; `
- H! u' Z0 v* y下一步证明在三维（3D）mammosphere而非二位平面条件下CD44hi细胞可以分化为两种CD44lo细胞亚群，也就是说只有在三维条件下干细胞样细胞可以转变为更分化的细胞群。这些CD44hi细胞表现出类似于人乳腺前体细胞的基因谱。
' ~* v8 U& G5 R
' x4 j" l  J8 i& T: `! l* W做完了细胞层面的工作，然后用这种类干细胞的CD44hi细胞重建人源化小鼠乳腺脂肪垫，进一步证明其干细胞性功能。同时发现这类细胞在二维培养条件下会保持其干细胞状态（不分化），结合上述三维条件下的分化结果，作者认为这提示特定niche微环境对上述细胞功能的关键作用。
1 `# r- {7 b" t/ m1 ]( g+ C( |2 G- u1 J5 K9 [. `5 P. Q
上述实验均是在培养的乳腺上皮细胞中做的，研究者又用新鲜分离的乳腺上皮细胞重复了转化为前体或干细胞样细胞的实验。结果表明上皮基底（basal）细胞而非上皮管状（luminal）细胞可以转化为干细胞样CD44hiCD24loESA−细胞。$ h# N6 |6 `6 m/ u  U; j
4 I1 g' M0 }5 C% y2 y. G3 \
下一步通过引入致癌基因，在癌变转化的乳腺上皮细胞中证明非干细胞样亚群可以转化为类干细胞亚群（CD44hi），由此类推，这些癌变转化组织中的类干细胞亚群等于所谓的肿瘤干细胞，提示非干细胞类肿瘤细胞可以转化为肿瘤干细胞。研究者还建立了一个通过有序引入致癌基因而逐步降低这种自动转化障碍的模型。
  B1 T- L; I# u2 B, U" a* e9 N
& [8 W; @( L+ r7 e. R1 {' |以上都是体外实验，下一步该研究组将不同亚群上皮细胞移植到NOD/SCID小鼠，然后分析肿瘤组织，证明上述可转化为干细胞样细胞的癌变转化上皮细胞在体内肿瘤中的确转化为了干细胞样肿瘤干细胞（CD44hi肿瘤干细胞）状态，构成肿瘤细胞群的大约16%。( \4 c3 W& D% Q. x

) g) a$ _! p9 A0 @7 V6 H由于乳腺肿瘤是一个多元成分的疾病状态，研究者最后比较了不同类型的非干细胞样与干细胞样细胞的成瘤性，及其相应的体外传代能力。结果表明，癌性转化的干细胞样上皮细胞成瘤性高，恶性程度高并且体外传代能力强。这部分结果的意义是证明，成熟分化的细胞与未分化或分化低的干细胞样细胞均可能导致癌变，但后者的癌变性远强于前者。也就是说，变性前的细胞的生物学特性（分化程度）很大程度上影响着癌变后的细胞行为。! d, Q4 w: \" P% U7 h
  Y3 v) i! O5 u/ |
研究者认为他们的上述结果颠覆了干细胞单向分化为下线细胞的经典理论模型，证明分化的细胞可以反过来转化为干细胞，也就是说“可塑性”是“双向的”，而且这种分化没有基因干预，是“自发的”，这种现象存在于正常以及癌变组织中。首先，这为消除肿瘤为目的的治疗提供了新思路，因为即使找到并消除了肿瘤干细胞，非干细胞性肿瘤细胞有可能在特定条件下转化为肿瘤干细胞。2 t1 r4 p1 P5 W# R) ^- h4 o" v
% ]' b1 J" Y$ f: D' c2 Q+ I
作者还推测体外观察到的非干细胞向干细胞的去分化式转化，在体内因微环境因素而更容易，比如EMT，低氧条件，并有多潜能因子（OSKM）的参与。因此，肿瘤干细胞可能受外在与内在多潜能因素的调控。本研究的另一个临床意义是通过证明不同状态的来源细胞决定其后的癌变行为，而可以解释肿瘤组织细胞的多样性。更有趣的是研究者推测，患者特异性以及组织特异性干细胞有可能用患者自身终极分化的上皮细胞在体外通过这种自发转化而获得，并不需要任何外源性基因改造手段，虽然作者没有用iPSC这个词。4 I' m" ~5 `8 r9 M/ n, W
' x4 |3 q* Y9 }( a: [2 `8 ^* i, _
总的来说，抛开技术细节，这个研究的有趣之处在于其技术手段并不花哨，从自然观察的状态入手，采用清晰的逻辑设计和有效的实验控制步骤，鉴别出所谓正常组织以及肿瘤组织中“自然存在”的细胞双向可塑性。虽然作者的讨论不多，但这个研究结果的潜台词却很丰富，直接间接地触及了细胞可塑性、双向分化、EMT、诱导多潜能、直接转分化、肿瘤干、肿瘤临床等。尤其是如果最终证明体内去分化过程的自然存在，干细胞的很多疑问都可以解释了，比如成体干细胞的来源与存在状态。顺便说一句，由此一来，干细胞的概念大大扩展了，干与非干，只是一个动态状态，而非固定形态。这其实更符合系统生物学的理念。
# K; o8 d+ Z  Y" q2 S3 z  [' P! j) }6 C9 q* w4 M) \5 P
当然，首先需要在体内确证这个乳腺上皮细胞的现象在其他组织上皮细胞中普遍存在。希望是个可靠的现象。+ d1 y* K, ?) x$ z: N9 M- m- S' E* M
( u  V* l+ N; P8 q
（原文由网友rs003在文献互助区提供，致谢）

shen_coco

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* ~% i4 W  s$ }- F4 }3 c0 {* [, B* Z$ a, U: _$ G8 ^5 g
写的很好，其实我看完这几篇文章，还是有几个小小的疑问，大家一起来探讨：第一，为什么在培养乳腺上皮细胞时，那些CD44LO细胞会漂浮？难道是因为它转化为干细胞的过程中需要悬浮这种特定的条件，可是后来分离出来的漂浮细胞也是贴壁培养的啊？
% d6 z8 z. {$ u% Q8 e$ p
" z9 n/ Y( w& @# `( K3 D* v* B第二：那些漂浮的CD44lo细胞与贴壁的CD44lo细胞之间有何不同，作者做过实验，一开始贴壁的CD44lo细胞不能转化为干细胞，这两者细胞之间基因有啥不同，还是蛋白水平有差别。作者没有进一步研究。% T; W) y! ?8 @6 ~+ r2 z: r

/ o# [4 L- ?- L( i2 T4 g4 G# n7 o+ m第三，作者养的上皮细胞是用MEGM培养基，全称是Mammary Epithelial Cell Medium，我不知道这种培养基有没有含血清啊（我推测MEGM应该是不含血清的），我也没养过HME细胞，有没有谁能告诉我，用MEGM养HME时，有多少细胞是悬浮的。如果换用含血清的DMEM或者其他培养基养，还有没有细胞漂浮呢。
% t2 V, S, l/ i2 x# U3 V" w% c7 i/ ^7 r
第四，作者用2D培养的时候，干细胞不会分化，3D培养的时候，干细胞出现分化，这是为什么呢？3D培养具体是怎么做的（原谅我文献看的少！！），3D和2D培养的最大区别在哪里？如果用2D培养，再加点血清是不是也可以诱导干细胞分化呢。
7 s/ t2 T5 G5 q# f5 o0 S0 G1 R% W7 K2 R9 l1 J! L, O
暂时想到这些，在仔细研读下这篇文章，确实很有意思，虽然文章篇幅不多，但内容很丰富，可以遐想的有很多，可以锻炼发散思维，哈哈
3 r6 w+ Z! k( B& Q4 @8 F( Y
/ M+ @/ }; m$ \! Y% D3 _" ]/ Y

tpwang

1 n% e) G. z3 }

shen_coco 发表于 2011-4-17 22:07 , _" X" ~. B/ [) @
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3 d% p8 d; U' z0 w0 J; ?
/ y* E; s. U4 g) y2 u; U/ a 写的很好，其实我看完这几篇文章，还是有几个小小的疑问，大家一起来探讨：第一，为什 ...

! V- x3 B0 p7 I; N" J; b0 ]
- o) o- O% A! M2 t3 V: F
确实这篇文章挺“绕”的。) Z& W8 r5 |1 p2 T+ Q

! i" o8 j8 z. E! c. g& J3 T0 G/ z6 ?飘浮与不漂浮的差别还不完全是CD44lo和hi的区别，飘浮与不漂浮的区别一是在于ESA+和ESA-，二是不漂浮的全是CD44lo，而飘浮的亚群中又分hi和lol两群。漂浮的lo可以转化为飘浮的hi，原始飘浮的hi和飘浮转化的hi都可以有干细胞样的特性和功能。
9 |0 N* h$ h6 V4 l) \
0 V8 |/ x- w. k0 g+ I/ u至于贴壁，作者确实没有进一步解释，根据上述情况，贴壁的与飘浮的亚群都有CD44lo，虽然后者还有一小部分CD44hi，大概这个相同之处导致飘浮的亚群在新培养基中贴壁了吧，但这也只能是个猜想。还有一种可能是乳腺上皮三种细胞中，luminal是ESA+，而basal和bipotent是ESA-，这可能也是贴壁与否与转化与否的一个因素。结论也是basal cells才可以转化。
* O8 R% g2 ]" _: J, l/ `4 q7 J2 N2 T/ |- ^1 U4 u
本研究中提到的3D环境，指的是体外的mammosphere culture，以及后面体内实验的环境。上皮细胞在2D培养条件下自然形成monolayer，加血清大概不是关键。
3 u' C0 ?/ u2 _. h' [, ^. Y( u* p, |8 T# R6 M
MEGM的问题需要查补充材料，不清楚。4 p6 d- N7 f  g$ e

# K6 T! w4 z/ s  j

shen_coco

回复 tpwang 的帖子9 J* M( T* ?, W3 r

+ P9 D. q) A' K' ^- y贴壁的细胞里面，HME CD44loCD24+ cells were ～51% ESA+ and 49% ESA− cells，有49%也是ESA阴性的啊，为什么这些细胞没有漂浮，也没有转化为干细胞的能力呢，可见最开始漂浮的ESA-细胞，与贴壁的ESA-细胞有本质的区别，作者没有深入研究。7 t+ ^( h; h4 v* F

9 P* n2 Y5 D" t! d- u, o6 ^我知道3D培养是啥意思，就是想知道具体是怎么操作的
# E; u- ~; T" a. G2 [% L1 h4 Y# }8 b0 {: l* z: Q1 p3 V2 ^
为什么我会提到血清呢，因为在养肿瘤干细胞的时候，一点血清都不能加，如果中和胰酶的时候加了血清，就算洗的很干净，也会促进干细胞贴壁和分化。我觉得作者用的MEGM肯定是不含血清的，我推测MEGM养乳腺上皮细胞的时候，应该有很多悬浮细胞，不然作者应该不会特意去研究这些细胞的

shen_coco

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0 b0 b+ l7 |% T* D8 q1 h
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MEGM是不含血清的，为什么那些细胞会自己悬浮，分选出来后又会自己贴壁呢

shen_coco

1 T% ^# A7 G; u. P6 p2 f4 y8 J6 C) B9 x# Z
ATCC上的图片上看，没有很多悬浮的细胞啊

tpwang

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, b; t3 D: i' I" @# }
$ I$ w' K/ W  G* K/ ^9 P# i0 S# _确实这是个问题，而且是存在于这个研究的逻辑前提上的。
' z& m7 P8 @1 v# s5 Q
9 S  D/ b2 a2 M, u* t" `: Z不漂浮的和飘浮的里面都有CD44loCD24+，而不飘浮和飘浮的CD44lo和CD24+亚群都有ESA-，而且贴壁与飘浮在CD44lo的比例上不一样。这些“共性”的存在不能完全反推作为贴壁与飘浮的区别的原因——如果从单细胞的角度来说；而反过来想两群有共性，因此都可能贴壁，只是有可能条件是不同的——如果从细胞群体的角度来猜想。后来归出来的三类中，HME-flopc-CD44hiCD24loESA−是作为所谓类干细胞标准的。理论上如果把三类反过来再比较贴壁与否，才是证明开始观察到的飘浮与否差别是否与这些标记有关，看来没关。理论上，如果贴壁与飘浮细胞的标记没有交叉，那就简单了，估计这是该文章没能发CNS的主要原因之一。从实践操作的角度来看，借鉴这个方法从哪里入手，从飘浮与否开始重复作者的程序还是直接用标记方法筛选（CD44loCD24+ESA-）作为可转化的好同志，似乎也没有很明确的说法。5 [0 |6 B+ |0 }6 j' z7 y4 D, n: ?& f
. B- C0 m1 Z+ J' o8 H% G, V5 k% @
这个缺陷好比逻辑推理的三段论过程中，大前提有了缺陷，后面的环节再严密，都有可能是“文学作品”而非“科学”。西游记里孙猴子和二郎神变幻动物互相斗法，大前提是不存在的，但后面的鱼怕鹰等确实合理的。4 F+ k4 y0 a/ a7 q6 E. m4 \

8 U( U) q+ g9 I* w# |呵呵，笑谈。; P. u( }# p- j9 }' j1 {
6 a; t7 _- J. f5 q

shen_coco

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1 B6 B) N& e! X- k0 n: o. R# a  I! x" o' w* t$ S7 E( R' a4 j8 v, z
确实，文章有点不严谨，但是作者对原代的细胞是直接上流式筛选的，而且成功了。