如何获取MSC单细胞悬液

alioli

最近因为实验需要，使用MSC进行动物静脉注射，但是发现MSC在培养体外过程中容易互相连接成膜，消化过程中也不易完全分离成细胞悬液。因为担心细胞团块会阻塞动物的小血管，希望各位高手指点，使用什么简单可靠的方法能够获得单细胞悬液？# f- [6 n1 p$ {" h  \) }( A5 t
我采用过筛网的方法，但似乎孔径较大，过滤不完全，请问多大的孔径合适？

Learner

我感觉应该将细胞稀释的比较稀，分次注射比较好。

dqm185

首先，我想你的主要问题还是处在消化和吹打的操作步骤上。查了几篇文献，都用的0.25%胰酶消化1分钟 （有一篇兔的MSC用0.25%胰酶和0.5mmolEDTA消化5分钟），但是1分钟的消化时间只是经验时间不是固定不变的，你应该以看到形状改变为标准才算消化完全，然后注意吹打使其变为单细胞，第一篇参考文献是为了做成单细胞悬液上流式（应该比你不堵血管要求高），如以下步骤：
0 x9 r7 D$ n+ a. w2 K$ t4 MMSC的传代培养 原代细胞生长达80%~90%时，吸净培养瓶中的液体， PBS洗涤 2次，取 37℃预热过的 0.25 %胰酶 3~4 mL，于 37℃恒温水箱内消化 1 min。镜下观察细胞见细胞从梭形变为圆形，以 10%胎牛血清的 DMEM培养基终止消化，吹打细胞，使细胞完全从培养瓶中脱落并吹打成单细胞悬液。吸取细胞悬液至 15 mL的离心管中， 1 000 r/min离心 5 min，移去上清，见离心管底部一层白色沉淀，加入 DMEM培养液，制成单细胞悬液。原代细胞按 1:2比例传代培养。传代后的细胞继续按原代培养的方法培养，直至下一代传代。共传代 3次。6 B# t7 c& X8 O7 O
参考：http://journal.shouxi.net/html/q ... 1538618_522387.html$ J$ P" i& g# o3 C8 h/ B: g& Q
http://journal.shouxi.net/html/q ... 2330946_168801.html
' o! `. K. D' Vhttp://wenku.baidu.com/view/fb1c8673f242336c1eb95e30.html
. u: e0 k! W( Z2 e: J' jhttp://www.paper.edu.cn/index.ph ... 80936-self-200810-6# T7 A7 ^8 z- u  d5 C# Y/ v0 S

dqm185

真核细胞直径一般在10-100微米之间，一般做单细胞悬液上流式测之前，用的筛网为100uM。: H5 [, `( y& [
对于你提到的静脉注射有可能堵静脉的顾虑：& ^! s4 Y  W# }: h+ X* X
首先，分析静脉循环：以尾静脉注射为例：尾静脉运送静脉血由尾部回心脏的静脉，沿尾动脉下方，与尾动脉共同通过尾椎的脉弓前行，多数情况是到体腔后左右分叉形成肾静脉进入肾脏，然后左右汇合形成后主静脉，但是哺乳类尾静脉不分叉，而直接连于后主静脉。/ d& C( R: R/ G: \2 J8 G  E# W
至于血液循环中血管最小直径：毛细血管是极细微的血管，管径平均为7-9微米。你所谓的堵静脉，我也查了相关的直径: 微静脉是最小直径小的静脉：直径为50—200μm的微静脉.5 m7 g8 K7 @- k7 i. s, [
总之，即使过滤了，也有可能堵。但是，只要做好了消化操作步骤，制成了单细胞悬液，堵不堵还真的重要吗？
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+ G) x9 k$ ^% ~7 Q+ G& Xhttp://www.docin.com/p-25187701.html
- c* `* h  Y+ l9 V# M% m/ P. Ehttp://www.wiki8.com/weijingmai_106145/& k; V1 q, O" @
http://www.zgxl.net/sljk/imgbody/mxxg.htm1 {3 J2 X# w9 F( p8 w+ L
http://61.177.62.26/zhuantiwang/ ... eb/zu34/004/048.htm

alioli

谢谢楼上的帮助。8 U6 \& O2 a+ ?. l4 v
我现在用的消化方法也是0.25%的胰酶，消化时间在3min左右。但是可能是接种的细胞不是很均匀，或者是细胞生长过程中速度不是很一致，导致有些集落细胞很密集，但有些区域密度却不够。我考虑细胞容易成膜是否还与使用的培养瓶有关，以前用的都是玻璃的反复使用的培养瓶，可能下一步换用一次性的培养瓶试试。/ O9 i! z, J) E8 g
我打算先在小鼠身上使用您所说的100uM的滤网试试，看是否有不良反应。毕竟多数文献证明MSC的静脉注射没有观察到有细胞栓子的形成。

zlh0206

请问楼主，你用几号的针头注射MSC的，新手，谢谢