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我是做胚胎干细胞的，所以给你总结了一下这方面的：4 v G% M& d2 B! E. _
1、囊胚法。这是最经典的方法，我们用C57和129.具体步骤如下： 囊胚→脱透明带(Tyrode 酸或链蛋白酶或机械法) →去滋养层细胞(免疫外科法或酶消化法) →纯化的ICM →适宜的饲养层上扩增ICM →离散增殖的ICM 为小细胞团块→重新接种在饲养层上培养→离散ES 细胞集落为小细胞团块→接种在饲养层上传代培养→出现多个ES 样集落→在饲养层上或无饲养层扩大培养→鉴定→ESCs 系。
3 S/ y+ x4 ^6 d) x/ y5 @2 D2、克隆胚胎法
- X& f# K5 M/ _$ y. S1 [. Y0 W& p将通过细胞核移植技术得到的克隆胚胎体外培养至囊胚, 分离培养其ICM , 进一步分离培养获得ESCs。克隆胚胎ESCs 的分离培养过程与囊胚源胚胎相似。克隆胚胎法分离hESCs 即是常说的治疗性克隆。采用这种技术可以为特定病人建立特化ES细胞系, 可望真正实现个体化的治疗。* Y5 p7 D# L% B" V. |
3、胚胎单卵裂球法
. i. o3 e" I4 ^采用附植前遗传学诊断技术自8 细胞期小鼠胚胎提取单个卵裂球细胞, 与100 个GFP 标记的129Svö CD ES 细胞在微孔内用类似ES 细胞培养的方法共培养。扩增纯化培养可得到ES 细胞系和滋养层细胞系。目前, 尚未见到自单个卵裂球细胞分离得到hESCs 系的报道。
& `: Q3 B; q" Y1 M/ d1 P4 PGCs 来源的ES 细胞分离 7 X9 \8 K( x g3 O3 T, v
在无菌条件下取胚胎生殖嵴及其周围组织，眼科虹膜剪机械剪碎，用0.25 %胰蛋白酶+0.04 %EDTA 室温条件下消化10 min，可辅以慢速磁力搅拌，然后用含10 %FCS 的DMEM终止消化，过滤，离心去上清，重复2 次后，将细胞制成悬浮液，调节细胞密度为104～105 个/cm3，接种培养。
! T' V! {' S- V* |9 B5、孤雌生殖3 U7 G2 s. W- X/ d/ ^% d+ w
钙离子载体A23187 和6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）处理小鼠卵母细胞，待囊胚形成后取出囊胚，以机械法分离出内细胞团细胞，在铺有饲养层细胞的培养皿中传代、扩增。培养液为高糖DMEM，内含20% knock-out 血清替代物、1%非必需氨基酸、1 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM β-巯基乙醇、4 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子。37 ℃、5%CO2培养箱中培养，3～5 d 后以0.05%胰酶消化，常规传代孤雌胚胎干细胞系建立后， 最主要的是确定其是否真正来源于未受精的卵母细胞
, b. N5 o+ b9 T- T+ m' N& C- v. j我这方面看得比较多，了解得多一点，有什么问题在交流。 |
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发表于 2011-4-19 10:40
发表于 2011-4-19 15:45
非常感谢！学习了