全骨髓贴壁法--兔骨髓MSC的提取及鉴定，有图！

pink1198

先介绍下本人提取兔BMSC的方法，然后请教大侠帮鉴定下是否正常。& I$ J$ f( K! f( J. g- c
我的方法是抽取骨髓，全骨髓培养法。取2月龄兔，体重1.5kg，5ml注射器抽取2ml:0.1g氯胺酮注射液1支及2ml:10mg地西泮注射液1支，肌肉注射2.5ml进行麻醉。剪去双侧髂嵴术区皮毛，放入含500ml75%酒精桶中皮肤消毒。碘酊再次消毒髂部皮肤，用含500U/ml肝素生理盐水1ml肝素盐水的5ml注射器及针头抽取髂棘部骨髓4-5ml,移入含8-10mlDMEM的15ml离心管内，放入冰盒转移至培养房。吹打均匀后离心，1200rpm5分钟，PBS再洗一遍，离心。弃掉上清。加入适量培养基含10%FBS及双抗，移入T-25培养瓶,培养基量为5ml左右。48小时第一次半量换液。隔天全量换。以后3天换。大概11天左右培养瓶见不均匀分布的细胞克隆群，有的大片地方没有细胞，有的细胞高度密集。这时1:1传代，含EDTA的胰酶消化大概2分钟，见细胞变皱缩变圆脱壁，培养基终止消化，离心。加入培养基接种培养瓶内继续培养，大概6-7天均匀铺满，进行P2代1:2或1:3传代。请教几个问题：
3 }8 n6 L8 g+ l) K1.我的方法是否可以？是否还有优越的方法可以借鉴？骨髓冲洗法我失败了好几次，容易污染，也是48小时第一次换液。以后摸索到目前的方法就没有采用骨髓冲洗。
; q$ g1 z0 o+ i% u0 }2, 我的细胞是否是MSC？发现到了第三代比第一代细胞变的更大些，细胞的触角也长了好多。1 [$ U; `8 X: s1 u
请高手指点，非常感激！
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pink1198

自己先顶下，继续问下，传代到了第四代我的细胞感激像成纤维细胞，宽大扁平，折光性差，是老化了还是成纤维细胞？如何克服这些问题？谢谢！

ly200101042

兔子的我没养过 我养过大鼠和脐带的，和你的第三张差不多
1 s6 B+ J4 ^6 k6 }, i  T) V1 d大鼠的骨髓我采用的冲洗法/ C0 j9 d/ I7 `( d6 D
我听过别人还有用过直接把骨髓剪碎贴壁的
4 c; h* K7 L& z% N我看了下你的方法，我觉得是不是应该用淋巴细胞分离液分离下。
# s; W  ?) W/ ?3 {我以前养MSC的时候，形态就和成纤维一样。

Learner

我觉得你的细胞形态还可以，就是别让它们长的太过融合，70-80%就应该传代。骨髓加入2-3倍体积的培养基之后，就可以直接培养，不用PBS清洗也可以。清洗后，骨髓里面的血清都浪费了。直接就放到培养箱里让其贴壁。第三天换液，也不要将血细胞都冲洗干净，轻轻晃一晃，吸取瓶底的培养基沿着培养瓶的侧壁或上壁加入培养液，尽量不要损伤细胞。第二次换液再用PBS洗两次，加入培养基。

1301918986

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. ?: ?' q: x4 [/ t4 A% z( p请教一下培养兔骨髓MSC需要加Vc吗？

pink1198

谢谢各位，今天请教了一位高手，是实验中心的一位返聘老师，从事细胞生物学研究十几年。看了我的细胞后说养的不错。所以更有信心了。我的是全骨髓贴壁培养法，未用Percoll或淋巴分离液，据说对细胞有损伤。也没有加VC。上图分别是原代和第三代时拍的照片。

1301918986

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呵呵，养的不错的就好。我最近也在养兔骨髓MSC，用的也是全骨髓贴壁培养法，只是加了Vc 培养。

1301918986

回复 ly200101042 的帖子
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请问你养的脐带的MSC能养到第几代？我最近养的到了第八代就老了。