胚胎干细胞的计数问题

always_wp

谢谢大家啦 我试过之后向组织汇报效果啊

懵懂干细胞

大家帮忙看看这个方法行不行啊？) L3 P; [4 P  Z. T9 V' B
我用胰酶消化，轻轻晃动，在显微镜下看到ES细胞克隆开始脱落并分散立马小心吸取上清至另外一个孔接着消化，
& i" `9 ~/ e0 V. i7 Q/ i8 D8 r然后就常规终止消化并计数，这样可以减少搅局的MEF细胞！  Q4 }$ q" ~9 Z% m5 Y9 y
可是应该也不准！

懵懂干细胞

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我用胰酶消化，轻轻晃动，在显微镜下看到ES细胞克隆开始脱落并分散立马小心吸取上清至另外一个孔接着消化，+ q4 s4 H0 e: _: z1 {& u
然后就常规终止消化并计数，这样可以减少搅局的MEF细胞！2 t' b! i( N+ Q) j2 m  _$ ?" @
可是应该也不准！

farmer

是个好问题，关注

hswu01

如果硬是要只对ES计数的话 你可以先消化，中和后沉降一段时间，因为滋养层细胞贴壁较快，ES较慢。等滋养层先贴壁，然后你在取上层悬液计数。这只是个人的想法，不知道是不是用。

llecstem

支持楼上，feeder细胞和ES相比，大了很多，并且形状不规则

dilal

你做细胞移植的话，难道不需要对干细胞进行富集纯化吗？如果移植时混杂有MEF，那么移植后的改善到底归咎于谁，干细胞？MEF？还是两者共同作用。
, }* f: Y+ |1 s; E) j1 Z! M& X有两种方法可以对饲养层的细胞进行纯化：
4 f/ a) i( c" y( v* a1、差速贴壁法：将消化后的细胞悬液移入到未用明胶铺板的培养瓶中，孵育20-30min后，轻轻吸取细胞悬液即可。; Q* }& L! l; ]. I
2、传代纯化：将消化后的细胞悬液种植到明胶铺板的培养瓶中无无饲养层培养，传代2-3代后基本上只剩下ESC。
% {' U7 n) _  I& I- M) H" C差速贴壁法仅能粗略地去掉大部分的MEF，仍将有一些MEF存在，但操作相对简单、方便；传代纯化能够较好的去掉MEF，纯化富集ESC，但是消耗的时间比较长。建议你根据需要选择一种。

yeya

这样也许可以，先都消化了，然后全换液，过半小时后，由于贴壁能力不同，MEF贴壁了，但是ES没有，这时候可以计数吧，只是在分离细胞时这样做，不知道计数可以不，而且换液后间隔的时间要把握好啊啊啊……

四梦学子

你的问题在于怎么去除MEF，我们实验室一般是将消化好了的MEF和ES cell加入到一个用gelatin处理过的皿中，置于培养箱中培养45min，轻轻晃一晃，然后吸走上清，上清里的基本都是ES cell，MEF的含量很少。再参照以上仁兄的分辨ES cell的方法计数就可以了

song1978

关键看lz要做什么样的实验。
! P; m- d7 s' H: J1、如果是分化细胞打移植，最好能在feeder-free的体系进行。貌似现在Millipore有一些适合feeder-free的培养基# p! W$ l; _* @* L  M
2、如果单纯去除MEF，可以先拿胰酶涮一下，移到明胶包被的板子里放十分钟，MEF就基本上全贴了