为什么做western老是显示在别的分子量的条带

人在日本

我做一个蛋白的western，分子量为120KD，可是在这个分子量总是没有条带，而在75KD左右却总有一条清晰的条带，已经变换条件试了很多次了，都是这样，这可能是因为什么呐

深海寂寞鱼

回复 人在日本 的帖子# d, K- _* |* ~2 s/ [
4 x" E7 p' f2 Q$ Q) V8 [( U( q# v  p
   
3 u5 u6 G% _# L: l1 N, O4 T! @3 p/ z      呵呵......不知道"人在日本"兄做的是什么蛋白啊?
+ K" ]3 \0 W  z8 z, E5 s( f6 {' O3 e% p
      难道是Notch 1 ?  瞎猜的.....
3 q1 S0 W$ s8 j! K/ K) C
- e$ A, N- C( ^) U$ E3 [( F2 V      蛋白条带和预期条带不符合时, 可以试着从下面几方面分析:
8 j2 n. u/ O5 ?3 V1 D0 m6 q' x. x: s
      1. 是非特异条带,还是特异条带?   - I  R' U7 R2 B2 e
7 }5 `+ q% Z) Q
       仔细研究一下抗体说明书,尤其是示例图片./ o! }; J8 a8 F1 {( u6 x# E" u
4 a% m0 B: `% C6 g8 |- u& B0 l
       这个问题的解决, 可以找个阳性对照(最好是说明书上提到的,或文献支持的),进行实验., o1 I' \  G2 p, ^0 L
* a, ?$ o1 P+ M+ A3 }% C5 @; F
      2. 如果是特异条带,那么它为什么不在预期的分子量范围?: }2 R! w! \. I

/ x; i- x, j2 S% U/ h& ^+ T      a. 这个特异条带是你想要的蛋白么?  如果是:& V0 v9 x6 R, h+ [

5 a' ?3 a- d5 E" Y, s1 b' \- p+ W5 S* x      i. 蛋白在激活/活化过程中, 被断掉了一些结构域或者肽链,导致分子量减低?
( N! L( e; P3 V: z5 ?         查查这个蛋白的激活/活化, 翻译后修饰等信息.  ?+ n9 u& _' U1 B. m; x
, O0 g/ ~0 f' J2 z& m; h
      ii. 蛋白被修饰了?
7 D2 I1 @' Z% X' X         当然通常蛋白被修饰后分子量会变大的可能性大.但是你也可以查查相关信息.% W3 C: K: P2 A! R7 o

* P% b* @8 s. w& [' Y- o      iii. 抗体说明书信息不准.
' F  M. j0 Y' d
- O* w: P. |) R! g1 }- w6 ~  w          我曾经用过一个抗体, 做出来的Western blot条带始终比说明书标识的小, 但是在阳性对照样品中也明显偏小. 结果一年后,这个抗体说明书更新了, 标识的蛋白分子量大小,和我的实验结果一致.  哈哈.......让人啼笑皆非.# M; f7 V! `: e# k9 F8 I( t9 d

+ Z4 J4 f& ], w* ~5 r6 E8 I       b.这个特异性条带有可能不是想要的蛋白, 那么:
, ]/ ], V! E4 W! ~0 E% z9 m# `* B7 l' I0 t! I$ Y* n, G7 Z9 Y/ i
       i. 会不会是和你的蛋白质有高度同源结构域的其它蛋白?, }6 U% w4 @* _* h" I: G& _& L
5 m2 V8 c: R! T: @! h  ~
       ii. 会不会你的蛋白质家族的新成员?
/ U( ?1 K" Y0 V/ V4 d
4 M& j# I2 K! {* w* [       iii. 会不会你的蛋白质对应的基因本身就有多种可以翻译成蛋白的剪接变异体, 而在你的样品中,恰恰表达的是另一种剪接变异体,所以分子量变小了.1 n. F3 a( D: k0 P4 Z; k
. v9 n9 q7 N7 R
      当然,以上都是理论上的可能性. 你的实际情况可能远远要比这个复杂.' F1 q% Q  A( z& y6 w' z8 x

" `, d' Z5 E& c. G' D      你可以提供更多的信息,让其它战友和你一起讨论.6 s& S1 S( E! z: ^7 C7 ]6 M. K
0 q% A' ?- f6 w: t. v% a
      希望,上面的信息能对你有所帮助. 欢迎继续交流.

人在日本

深海寂寞鱼 发表于 2011-6-26 12:28 4 t% G, n/ C0 s% X! u' J9 n5 d9 a
回复 人在日本 的帖子
* a; U0 o/ I, S# L
, c$ B3 i0 I/ M% _4 C& M2 a   

( O. z5 L9 r# W2 V& G0 h% }7 O9 I7 w
非常感谢啊，我做的是Hif1a蛋白，到现在一直没有做成功过，我觉得非特异性背景非常的高，我在最后显影的时候，在暗室里把膜与胶片轻轻一接触，有时也就是三秒左右就分开，然后就洗胶片。如果膜与胶片接触时间稍长，结果就会漆黑一片，什么也看不到。! ?+ @) c1 k2 z( }( b* D
7 Q7 \' A" n3 f- r2 y- `5 ?! z2 R
Hif1a分子量为120KD，我做的蛋白总是在75KD左右，我不知道是蛋白分解了，还是因为我让膜与胶片的接触时间太短，导致目的条带没有显现出来，所以想在这里求教各位高手

yxc

   请问，你把各个环节的问题都排查了吗？
' C9 |0 D: ]3 ?# ]1 D" @* x   最不可理解的是你把膜与胶片接触三秒左右就分开，然后就洗胶片？如果膜与胶片接触时间稍长，结果就会漆黑一片，什么也看不到，是不是说明了胶片或显影液有问题。' [$ p, x! h' Z2 A6 _( m, \
   设置的内参怎样？) Y: A0 Q5 e' A" w0 A6 P) q
   其他相互扶持的实验方法有吗？结果如何？

人在日本

yxc 发表于 2011-6-26 21:10 + N" I5 J$ Q' O5 l# Y
请问，你把各个环节的问题都排查了吗？4 z. ?/ H5 \2 x+ K- z
   最不可理解的是你把膜与胶片接触三秒左右就分开，然后就洗胶 ...

+ h. \: |, f, p很奇怪的，一位师兄做就是什么也显不出来，我做就是背景太深

yxc

    呵呵，两个人好好比较一下试验方法和用的东西，或许就豁然开朗了。

yxwh

深海寂寞鱼 发表于 2011-6-26 12:28
7 {4 C8 h8 D7 ]. B. N7 q5 K回复 人在日本 的帖子/ \8 f6 o" d( P, Q% M& L, ?7 e8 ]

2 S+ D% U5 V' `% c2 q6 c6 \   

0 w9 G; z% \* K3 b0 V. ^
分析地太棒了！！！
4 d* n9 }4 G: z2 p- \$ I% u: j) ~目前我的实验也出现这个问题，正在想办法呢！！！

yxwh

Hif1a好像非常容易降解，好像在正常细胞内可存在几分钟或者10、20分钟，的确不太好做！
9 h( A" A  z3 @) J0 u) k中山大学的高国全老师已经解决了这个问题，你可以看看他的文献资料！

人在日本

yxwh 发表于 2012-1-15 09:39 ' v2 H7 r9 Y+ O& L, q1 R, x
Hif1a好像非常容易降解，好像在正常细胞内可存在几分钟或者10、20分钟，的确不太好做！
( X5 p" I( G! c( k中山大学的高国全老 ...

3 l+ x) `8 u5 O
你好，请问你有他的关于这方面的文献吗

yxwh

我只是听高国全老师讲座才知道的，我不做HIF方面。你可以查一下高老师的文献资料。