测序怪现象

hdc2001

我用1条引物测一个片段，550 bp左右，前两次用这条引物测序，能测出我的序列，但600 bp后面信号为双峰或衰减。
+ n; }/ l. ?! D& L3 H- s我用含有这个片段的质粒重新构建了一个质粒，有10 kb，然后用这条引物测序，2家公司测了几次都是同一个现象：550 bp的片段只有前面230 bp左右比得上（见图），后面的序列都比不上，这究竟是什么原因呢？大家遇到过这样奇怪的现象吗？而用含有这个片段的质粒中其它引物测序，却又测不出反应。) x) w1 Q& E( W& |1 l

jun8013

双向测测，不过你这片段单向应该够了

langziforever

回复 hdc2001 的帖子! ~9 w" @" e# `& x5 M$ \' h
' ]! n; V; ~" k: i4 C
600bp后是双峰是正常的，只能说明那个公司测序长度只能保证600了，不过目前sanger测序应该在800以上，不知道你的序列里是不是有太多的重复序列或者二级结构导致的，但是既然前面你用质粒和你的引物可以测到你要的序列，而用这个质粒构建了另一个质粒就只能测到前面230bp，那需要你检查一下质粒构建过程中有没有问题，会不会你的序列里包含了你使用的酶切位点，导致你克隆到后一个质粒上的其实确实只有这230bp。所以，如果你载体序列已知的话，比对一下你测序的序列是否有载体序列也可以知道。另外，有时使用自己提供的引物做测序效果经常不好，你也可以尝试用载体上的引物去测序，毕竟你目标区域只有550bp，一个反应就可以了！

linzi0214

碱基的插入和缺失会导致测序的双峰现象。也可能是条带不特异，虽然跑胶看到可能是一条带，但如果电泳时间延长会跑出其他条带。或者你扩增的基因有其他亚型，这些基因编码序列存在重叠，或导致出现双峰或序列出现的是其他基因。可以将后面扩增的不确定的片段在Blast数据库中进行核对，可以找出是什么基因。质粒测序可以用载体的通用引物双向测看看，插入片段是不是你想要的

Andyhigh

回复 hdc2001 的帖子" w( A0 K1 G6 k+ q
6 Y# r* O  }* {
你哪个学校的啊？姓刘？？？