培养的海马神经干细胞总是长不好，求助各位高手老师牛人，我实在找不出原因了

tk1504008

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我养的是新生大鼠（24h）的海马神经元，取海马后，剪碎，0.25%胰酶消化15min，含血清培养基终止消化，1300rpm离心5min,弃上清，用无血清培养基+2%B27培养，每个皿2ml，24h后全量换液，每隔3天半量换液。
9 Q% M6 [3 W2 e    很奇怪的是：在显微镜下看，培养皿底部环境很不干净，细胞周围有很多杂质，形状想很多小黑点，有大有小，不知道这些杂质是什么，是组织碎片？死亡细胞的裂解碎片？还是其他的？5 U; K; a4 I6 ~
    我本来以为是因为离心后弃上清时，留下的液体太多（我一般留1-1.5ml）,前天做实验时，离心后，我把液体全部吸干了，但是杂志还是很多，我实在找不到原因了，请高手大牛指教
; F0 a, c- t  p! T  w' C     第一天全量换液后，杂质依然存在，虽然比换液前少了一点，但是还是很多。滤网滤不掉这些杂质，因为它们比细胞要小很多。杂质多的话细胞死的就很快，而且长得很不好。这些杂志是不是我取海马时，附带了很多周围结缔组织，所以杂质才这么多？8 ^* C; n3 x$ T1 U% ~0 g
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get0715

首先我有两个问题想问一下：7 a: V! y0 [" ~- \
1、我想问一下你的无血清培养基指的是哪种？除了2%的B27不添加其他因子了么？
0 r& Y4 a. {4 d1 |' ^9 N2、你的照片是培养几天照的？
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$ J4 r: Y, q7 |* n! Q0 b从图片上看你的接种量太小了，神经干细胞的接种量建议在1*10·6/mL。图上已经有很多细胞已经贴壁分化了，如果继续培养需要换瓶了。2 P& P, A8 V# H; a
有关杂质的问题，曾经我也很纠结，也请教了比较厉害的老师，不过也都不确定是什么，只是说有可能是细胞碎片或者是细胞代谢物等。有个方法你可以试一下，只是也不能去干净，只是能稍微好一些。可以将细胞悬液收集到离心管中，然后静置15min，或者低速离心2min，小心吸取半量的培养液，再进行离心，不过这种方法是在你有足够的细胞量的前提下使用的，这样肯定会损失少许细胞，仅供参考，呵呵！

yxc

    原代培养时总会伴有一些细胞碎片、死细胞、聚集在一起的细胞，培养条件只能存活一部分能适应的目标细胞，其他细胞逐渐死亡，这正是选择所用培养基的主要原因。不用过于担心，经过几次传代，自然就会减少、甚至消失了。
9 [+ z: J4 o* [   过多的碎片、杂志可能是因为剪碎组织过度、胰酶消化过度等原因造成。/ j! k, Y. x) n1 r3 T+ s- \; {
   

tk1504008

回复 get0715 的帖子
, c5 u' @- o/ e. w% A1 F0 l+ @9 A
  D5 {  g; D- S/ A; M/ v你好。我用的是DMEM培养基，除了B27没有其他添加因子。这是接种后第二天照的: M: q: H2 L4 D. Z, }' T

get0715

你的培养基体系完全不对，如果说细胞状态不好和培养基有很大的关系，我建议你还是多查阅一些文献，我看的神经干细胞的培养基较多用的是DMEM/F12，因子也要加，最起码也得加EGF和bFGF，我也好长时间没做了，所以只是提醒你需要改培养基了。

dingyx2009

我也很是疑惑你到底是养神经干细胞还是海马神经元，请说明一下。
  y$ b, h6 L4 d如果是干细胞你的培养基就选错了，应该是DF12+2%B27+20ug/m L EGF+20ug/m LbFGF,这样养出来的干细胞是悬浮生长的神经球，不应该贴壁的。
. h' f& a; [8 k3 _& r如果是海马的神经元的培养，DMEM+B27无血清培养基是可以的，不过看你的照片细胞密度不够。原代培养的神经元培养，有密度依赖性。太少细胞也是不长的。再者，好像养神经元有其他的无血清培养基，你多看看文献。5 j( m0 E( f; b
视野不干净有碎片可能是细胞碎片，与消化的时间长短和吹打力度都有关系。最初几天多一些，随着换液会减少并消失。
- D5 L. z. p8 C1 [4 @

superlamp

首先，从图片上看，有些不像海马神经元，而且你培养环境中杂质太多，会严重影响NSCs的存活或者活力；
  @) i: g! r1 T  q8 p其次，你选用的培养基决定了你也不太可能培养出NSCs，培养基成分是具有选择性的，
! M9 [& L0 E/ h4 a: b         我们现在用的是DMEM/F12+2%B27+2%L-N+1%LG+1%EGF+1%Bfgf；
1 b6 ]( a8 e) H. Y3 c5 I/ B7 d# Q再次，你的NSCs都贴壁了，也说明不太正常，应该是多层悬浮的；8 B5 D0 K, Y+ B
最后，需要说明的是，NSCs培养初期，需要高密度刺激增值，并可以帮助尽快剔除挑杂质细胞，你的细胞密度太低，同样可以造成细胞死亡。
3 d+ U2 u/ {7 W# L对于细胞碎片，离心换液的速度是很重要的，通常需要800r/5min，去上清，培养至第5代才比较纯；3 B4 V, i4 y2 G* i$ O1 P
如果说是分化，你的细胞分化的形态也不对，伸张的“触角”成线状，而正常的不是这样，你可以到论坛里寻找些图片做参考。
; R: f, b- \, c# u综上，你的不太像NSCs，方法需要你多参考文献内容。

tk1504008

回复 dingyx2009 的帖子9 {' M# Y6 k: E" Z; Y

, Z4 u5 D2 i& ?, U2 {" n  b* T你好。谢谢你的帮助，我养的是海马神经元，不是神经干细胞，背景不干净，有很多杂质是一直让我很苦恼的事情。
6 K- L8 ^* T, j+ I' [  f4 e3 T* v我的实验室要拍照，然后测量神经元图示的长度和分支个数，所以不进行传代，只是细胞周围这些密密麻麻的杂质让我极其崩溃，它们导致我的神经元活了4-5天就不行了& g4 e  D0 R  m9 d

daviegao

Your coulture medium is not good enough for NSC proliferation and growth factors are the essential for self-renew and inhibit diffferentiation.The basic medium should be DMEM/F12 for neural cell culture including NSC for sure.
% h' L% B: ~( ^, C/ F  Z0 _0 o2 K2 c9 b. W* J6 r. v! v6 m/ \( T
recommend mechinical dissociation using the pipetter tips instead of trypsin during primary culture.& j  u$ X# O' r5 W; p. h0 o/ S  R

wangfang

应该不是取材时的问题，因为我做神经干细胞的原代时也是从海马取材，原代培养时也会有很多这样的物质。