使用CD24CD44流式抗体标记测定乳腺癌细胞中干细胞比例的方法

lanxiubala

我想先检测一下乳腺癌细胞中的干细胞的比例，请问要用多少细胞上机？十的六次够吗？一瓶长满的MCF-7差不多是十的六次吧？

lanxiubala

没有做过关于流式抗体标记的实验，哪位做过啊？有没有具体的步骤呢？

lh_kitty

可以的，不过要设对照组，一般要求每个组细胞就要10^6细胞。

龙之吻

一瓶可以达到10的六次方，一般流式上机不低于10的五次方。注意吹打混匀细胞不要太用力。

daviddow

可以

amosummer

10的7次方可以好些，第一细胞量多，分选出来的阳性细胞相对容易检测，第二也能节省抗体的用量，因为6次方和7次方估计你用的抗体量身相当的，而且对后续实验也更好啊！

lanxiubala

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+ ]+ U. R. g1 @" T9 U$ B+ L- |6 K% ~) @" X# M& T  b! p
我买的是BD公司的流式抗体，一抗，1次试验可以做十的六次方个细胞。我现在是这么想的，先想检测一下干细胞含量，然后在做流式分选，主要也是考虑我没有做过流式抗体标记的试验，害怕第一次就做十次的抗体，万一失败了，很浪费；所以我现在就像先检测一下干细胞含量，顺便熟悉一下流式抗体标记的操作，如果能成功，再进一步分选。但是我现在不知道，做干细胞检测的时候，上机十的六次方个细胞是否能够将其中的干细胞（含量在百分之一到百分之四之间，也就是似的四次方个细胞）检测出来？

amosummer

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; `, O& J) N; y9 E: t3 @$ D% G  _
5 m  I/ |- Z: {. c流式还是很灵敏的，一个细胞都能检测出来，你的应该没问题。

lanxiubala

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5 K( m5 ]0 P7 J9 I% P' {
, X9 _* b, I8 [% Y( N4 G谢谢啦，请问你有没有做过流式抗体标记呢？具体步骤是什么呢？需要注意的地方有哪些？我是第一次做，很害怕失败。。。

RIVA2011

看你测得CD24和CD44应该都是胞外检测吧。一般步骤如下：$ E/ ~1 y* u- N0 E$ e
1．调整样本浓度，如有必要，用1*PBS 稀释为2×107 cells/ml； # I7 ^3 y+ l  y: a* K" P) k
2.管编号1#、2#、3#、4#，加100ul样本；- K5 g3 ]5 x* i$ g3 z5 m
3．按照下表加入抗体各10uL，混匀，室温避光反应15 分钟；
" D, v5 a3 a3 B% |4．1*PBS 洗一遍；/ Q" N5 F; E3 u* N+ x( p
5.离心，弃上清；. J' P$ X7 [. L; D- A$ h9 k+ z' p% J
6．加500ulPBS重悬上机。
( a# F: f% G, [% e) t1 I4 |1#（对照管）        γ1  FITC                       γ1 PE
; y+ c: g+ c& Q2#（补偿管）        CD44 FITC         γ1 PE ! m0 M# l* N+ {$ s9 k- U7 B
                           γ1  FITC                      CD24 PE
6 d; l% Z% U& B: y  B3#（试验管）        CD44 FITC        CD24 PE
$ K) a" q& B; W/ a! B9 o5 r6 w, U: x! `- J6 O& f) G