扩增质粒时的摇菌问题

pla269

大家在扩增质粒（大提）的过程中，为了提高得率，摇菌时一般有什么具体办法？先用15ml离心管摇菌时用多少LB培养基，多少菌，摇多长时间？然后往大瓶里放多少菌，摇多长时间？大家指教一下

Temin

我们喜欢用可以透气的摇菌管，有种BD的大概15ML的管子，具体货号不记得，它能透气，让E.coli长的密度高一些。加入的LB在5ML左右就可以。你说大抽的话，我建议用50ML管子菌液会多些，可以摇菌20ML。也可以用透气瓶盖的三角瓶，可以摇菌50ML-200ML不等，看你需要的量了。总之，我认为要得到多的质粒，就需要多的菌液，所以觉得透气培养比较好。至于接种密度和摇菌时间，我们一般按照1/20左右接菌，就是500UL接菌10ML LB培养基，摇菌过夜（16小时左右）。希望能对你有所参考作用。

lemma710

大抽的话我一般都用大的锥形瓶的，瓶口用纱布封紧。摇菌最好不要超过16h，过了菌会老。加菌我按1:1000加，1ML+1UL的菌。大抽质粒太多了也不一定好，它柱子都是有一定的吸附能力的，而且裂解的时候菌太多了会裂解不完全，这些都会影响抽出质粒的量的。试剂盒里应该有建议的菌的量的吧。

pla269

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; k0 ]$ Y0 @( {' I6 |! t  C2 P
有的技师说摇4-5小时就行了，不然死菌太多，菌的生长也受抑制了，也有人强调要过夜摇菌，你怎么判断菌量啊？

痞子的烟头

正常是先挑菌落，于15或20的玻璃管内 5ml LB摇过夜，第二天，将5ML倒入250MLLB中，再摇过夜，基本上就可以了，提的量绝对够！注意均要加入抗生素，

pla269

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你是怎么判断菌量的

Temin

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  o: O6 Q' \/ X$ V% ^4 m
( t$ `+ b: e0 H# {我们正常的流程是：
# x. {  n8 X- a, P: o第一天，下班之前也就是5点钟接菌，37度震荡培养；
/ V# E( x; @, L第二天，上班的时候（9点钟）收菌，培养的时间也就是16小时左右。
) ^# H% U! [7 V) d8 A基本上是目测判断菌量的多少，很久没有测定过菌液的OD值，我忘了是0.6-0.8还是多少，你可以自己查一查分子克隆手册。凭着经验，看起来比较浑浊就差不多了，因为我提取质粒一般是用作细胞转染，按照我们以往的实验，都是大致这样的流程，所以没有很细致的去研究这个。
; x: m1 s- ]' k摇菌4-5小时的话，在我们这边不大合适，因为这样接下来还得抽提质粒和验证质粒需要花费2-3小时，那样一个工作日就排满了，有可能做不完还得加班。
7 f0 ]7 u0 N# K: [  R- P我觉得在基础实验这一块，尤其是商品化试剂盒非常成熟的基本实验技术，第一次第二次认真参考实验手册，这样你就会得到自己的判断，如果只是简单的得到质粒作为后续研究使用，你大可不必拘泥于实验手册，毕竟每种菌、每种质粒有自己的特性，怎么方便实验流程怎么来。

jun8013

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; m4 I# f; y7 _6 d( z* B# |$ o1 ^测OD值，我们一般锥形瓶，100ml 1%接种量，你说的4-5小时应该是在对数期，OD应该在0.4-1.0之间，抽提质粒，我们一般是过夜培养12h即可，有时8-10小时。没有必要那么准确，主要是在你后面solution I II  III与你菌体比例要做好，你的抽提试剂盒上应该有写

susanliuxue

为了提高得率，先用15ml离心管3mlLB培养基摇菌过夜，然后吸取100ul去大摇过夜。

huangcong1988

其实摇菌的多少，要看你所用的试剂盒，你如果是大提的话，一般必须得100ml LB以上，所以，你只能用锥形瓶；如果中提的话（50~100ml菌液就行），你还是得用锥形瓶，因为一般的离心管都盛不了那么多的LB，有人想用50ml离心管摇50ml菌，这个是很不可取的，因为50ml管虽然可以盛下55ml左右菌液，但是加了50ml lb后，瓶子里面就没什么空间了，这样很不利于菌的生长，另外，这样摇菌的话也摇得不均匀；如果是小提的话（10ml就够了），那么用50ml离心管就行了。菌液是否摇好主要看其浑浊程度，有些人说摇菌时间太长会长杂菌什么的，我暂时还没有过，不过我个人觉得摇菌最后就是直接摇菌过夜，摇完之后如果有事不能立即提，可以拿出来放4度，那样菌液还是可以保存一段时间的