求助，逆转录病毒感染后MEF变圆，细胞漂~

sunshy2772

     我用Pmx逆转录病毒感染MEF细胞后，12小时后发现细胞基本都贴壁的很好，基本上没漂的细胞。但是，在换液后观察细胞变圆，有些细胞已经飘起来了。开始我以为是直接换干细胞培养液的问题，可是，今天我首先用MEF培养液换液，可是细胞也出现问题了~究竟是什么原因呢:'(
/ @* i6 @( E- `, c# }) C     我用的病毒液是新鲜的，没有浓缩，4度下保存的，我想是不是因为病毒液用的多了呢？我用的是48小时收集的病毒液，每孔2mL感染的。盼望各位给予解答。我都快愁死了~
% C" i- u+ u, d1 W$ O     还有一个现象，就是细胞不贴壁。这是我做试验以来碰到的最大的问题，细胞养的好端端的，只换了一次液，就飘起来了；要不就是细胞状态不好，长的速度慢；要不就是，细胞一直长不起来，长着长着就漂了，一直找不到原因。养个细胞容易么:'(:'(

scottist

MEF细胞还是很容易养活的，所以很可能是病毒加多了。6孔板加的话，不必浓缩的病毒上清2ml/孔都算多的了，何况是浓缩过的，细胞顶不住了，所以就圆寂了，飘了。议测一下滴度，便于有的放矢。

wwwert

你们病毒用之前不titer吗？0 u# G9 l9 V6 t, G
至少也要做个梯度啊

sunshy2772

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+ ?. k+ X+ P1 o0 V7 a" j: B6 {) Q& l# m
测滴度好测定吗？我听说滴度不好测，我们实验室没测过~

wwwert

回复 sunshy2772 的帖子- }' l  j6 Q1 Z) P7 ?0 s: O' y+ P( `
% R. z! r- q# T0 w' X
用双向载体最方便,一边表达目的基因,一边是荧光蛋白(最好是dGFP之类),用流式测滴度,很简单
! I9 K) G  Q5 _% D要么就用real-time PCR
  h3 E5 Y) _- Q3 d* y2 g% @- w7 t
7 }, [6 B) \  r+ `2 h! ]: ~基于抗原的elisa试剂盒也行,3 v- C* u; x9 W
但我个人不太喜欢,感觉不准,因为包出来后无感染力的病毒应该很多的

sunshy2772

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- s& _! K0 r" v
% V* h- G- X7 a8 Z0 f谢谢你，我的是一个载体，如果和GFP两个载体是分开的话能用什么方法测定呢？9 P! L8 _, ^+ l* u# R

大刀无敌

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! M& j6 u; U9 `: l7 _4 o# X
  u1 E5 x/ f! N* C3 }9 G4 _你可以用相同的条件生产GFP病毒做对照，用同样的病毒量感染细胞，然后计数发绿色荧光的细胞数算出GFP病毒的滴度，进而估计出你实际病毒的滴度。

sunshy2772

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  D" e0 _" O4 Z/ h) Q  ~0 o/ h
( u( T2 x0 r' `: M- @" p( Q师兄是版主啊，呵呵:)

wwwert

回复 sunshy2772 的帖子0 A( u7 W' g7 ]- q) |
& }4 w  f* ~3 F9 _2 Q
这种情况我们一般是用realtimePCR来titer的, 原理和流式差不多
. v6 P% L; {4 A$ Y; r就是作一系列梯度transduction, 然后取小于25%细胞感染的孔来计算titer（因为这时大部分转染的细胞都是单病毒）。
, [# ?4 s7 [! h. }* a: ^
6 }  T% M& D* U$ j, ?$ Q( J6 J我们是做基因治疗的，所以所有病毒都要求测实际感染的滴度
0 Q3 O7 a' l1 y' i其实我觉得如果就是转一下细胞用没必要这么严格，直接用RT-PCR定量病毒总量就可以
; l# V8 U: j; F6 l有一片文献：http://www.nature.com/gt/journal/v6/n7/full/3300948a.html
7 \, ]( s: f" H4 o, P8 f

cicadacjk

逆转录一般不会出现细胞大量死亡的情况，建议考虑其他培养过程的问题2 e( G3 i1 J! _# G2 W
另外，你可以只加1/10的c-Myc先看看，c-Myc太多细胞也是会凋亡的