两种精准修复人类干细胞点突变的基因编辑技术：ZFN和TALEN
( g8 B0 u4 ^' W2 p' X【towersimper注：本文为译文，有较大改动，仅用作研究之用，不得用作商业开发，转载请标明翻译者towersimper，原文来自Bob Grant, The Scientist, "Zinc Fingers Bear Fruit", July 18, 2011】
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一、锌指核酸酶(ZFN)基因编辑修复点突变
. t$ W% }5 I, ]- V( |; j) \$ m一种准确的基因编辑方法能够改变人类干细胞DNA上引起疾病的点突变( r. t' L4 c/ \% n7 \
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$ a0 g0 j* t$ l2 n) y结合到DNA(橙色)上的锌指核酸酶(蓝色)，图片来自维基共享资源，Thomas Splettstoesser
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锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般3~4个)，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族(transcription factor family)，在真核生物中从酵母到人类广泛存在，形成alpha-beta-beta二级结构。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，骨架结构保守。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。
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- c$ V O+ m5 M: h- T* U8 f 现已公布的从自然界筛选的和人工突变的具有高特异性的锌指蛋白可以识别所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计ZFNs。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时(6~8 bp)，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。
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7 D* I5 N8 Y: s. W 研究人员第一次在人类干细胞中修饰了单个引起疾病的突变，同时也不用改变干细胞基因组的任何其他部分。来自怀特海德生物医学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)Rudolph Jaenisch实验室的科学家们利用锌指核酸酶# S0 p5 p- R" c) w4 M4 _6 O
(zinc finger nucleases, ZFNs)在诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)α-突触核蛋白(alpha-synuclein)基因---已知该基因在帕金森疾病(Parkinson's disease, PD)上发挥作用---小心谨慎地插入或移除单个碱基对。这种精准而又定向的基因操作可能避免诸如病毒介导编辑(virus-mediated editing)之类较杂乱的方法产生的问题，而这些杂乱的方法就会使得将干细胞作为治疗试剂的努力复杂化。这种精准对于帕金森疾病和其他疾病的药物研究而言是理想的，而且它也是将胚胎干细胞或诱导性多功能干细胞用于治疗上的重要一环。该项研究成果于2011年7月14日在线发表在Cell杂志上。! C0 j$ h; k" Z5 D& P" M
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病人特异性的起源于体细胞的iPSCs为人类疾病研究提供一种独特的工具，同时也作为细胞替代治疗的一种有希望的来源。一项关键限制在于不能够在遗传明确的条件下开展实验。这对于晚期发作的疾病而言尤为相关，因为在这些疾病中，据预测体外显型(phenotype)对遗传背景差异的显著性效应较为微妙和敏感。通过结合锌指核酸酶介导的基因组编辑和诱导性多功能干细胞技术，研究人员对这个问题给出一种通用的解决方法，即就PD而言，通过修饰α-突触核蛋白基因上相关的点突变从而产生成套的等基因疾病(isogenic disease)和对照人多功能干细胞，这两者的差别只在于它们为两种PD易患型变异体中的一种。该方法具有对病人起源的人iPSCs(huamn iPSCs, hiPSCs)中引起疾病的点突变进行基因校正的强大能力，代表着基础生物医学研究的巨大进步和基于人iPSCs的细胞替代治疗方面的一次飞跃。! O+ U0 \, g; P& E; D/ b9 k/ |
3 B! C; Y: W F# b% D$ P+ g8 YFrank Soldner, et al., "Cell Generation of Isogenic Pluripotent Stem Cells Differing Exclusively at Two Early Onset Parkinson Point Mutations", Cell, 14 July 2011, doi:10.1016/j.cell.2011.06.019.
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二、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)基因编辑修复点突变
: H1 ~( ^& N7 J/ yTALEs (transcription activator like effectors)首先是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现的，特异性地结合到DNA，在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。( F; Q$ J* _+ `: ]
1 @( ?' V+ M* Z) b1 y每个TALE含有一个位于中央的重复区域，该区域由通常为33-35氨基酸的数量可变的重复单元组成。正是这种重复序列结构域(repeat domain)负责识别特异性的DNA序列。每个重复序列基本上都是一样的，除了两个可变的氨基酸，即重复序列可变的双氨基酸残基(repeat-variable diresidues, RVD)。TALE识别DNA的机制在于DNA靶点上的一个核苷酸被一个重复序列上的RVD识别。, e, j1 w' |3 z( X! o
一个TALE上用于序列特异性识别的DNA结合结构域融合到一个在DNA序列产生双链断裂(double strand break, DSB)的内切核酸酶的催化性结构域，便产生了TALEN。TALEN的DNA结合结构域能够在一个较大的识别位点进行高精确的定向结合。
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TALEN被定义为异源二聚体分子(两单位的TALE DNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域)，能够切割两个相隔较近的序列，从而使得特异性增强。它在用于基因组订制化(genome customization)方面表现出较高的效率和潜力。- ~8 u- D2 ?! c! V
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TALEN产生的DSB能够通过以下两种途径进行修复：$ s; C0 j% S$ S! @
同源重组(Homologous Recombination, HR)：DSB促进同源重组，在一个DNA模版存在下，能够产生特异性DNA序列改变，也能够将转基因整合到DNA序列上。% T8 w2 t2 Y+ W$ W+ ?
非同源末端连接(Non Homologous End Joining, NHEJ)：NHEJ是以自然修复机制，能被用来引入核苷酸缺失以便失活或敲除一个特异性的靶基因。7 w4 D5 x! o$ L/ C7 f
' q$ ^) y$ g6 V& o更多关于TALENs信息可参阅下列文献：( b7 ^3 Y* w& ?: [( v
(1) TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain. Ting Li, et al. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 1 359-372.
: L, Z- S. B4 u$ }" C0 ]( q* ?% X0 u0 b(2) Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Feng Zhang, et al. Nature biotechnology: published online 19 January 2011; doi: 10.1038/nbt1775.
0 s6 w7 }/ w$ D3 J# D# {1 k(3) Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases. Michelle Christian, et al. Genetics 186: 757-761 (October 2010).$ A4 X* H% s! d! G
(4) De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks. Magdy M. Mahfouz, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jan 24.- ^7 o, p6 V/ @9 K5 F) \2 D" G3 n
(5) A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Jeffrey. C. Miller, et al. Nature Biotechnology Articles: published online 22 December 2010., i A6 Y4 O' k8 p. ]! q6 F, C
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在2011年7月更早的时候，Rudolph Jaenisch实验室的两名博士后利用拥有类似于ZFNs的基因编辑能力的转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases, TALENs)在人类胚胎干细胞和诱导性多功能干细胞中准确而又高效地编辑基因。这种研究成果于2011年7月7日在线发表在Nature Biotechnology杂志上。& B, N0 N Y/ w6 ~
0 C. _+ R* M8 y对人类多功能干细胞进行定向的基因操作是探索它们全部潜力的先决条件。这种基因操作能够通过位点特异性的核酸酶实现。这里，研究人员针对5个明显不同的基因组位点改造出TALENs。在所有测试位点中，研究人员获得只在TALEN指定的位置上携带转基因盒(transgenic cassette)的人类胚胎干细胞和诱导性多功能干细胞克隆。数据表明在人类多功能细胞中，TALENs调控位点特异性基因组修饰具有与ZFNs相似的效率和精确性。# e2 z3 Y8 n* g- ]9 n* |& d
9 ~- D1 f& G. E6 o# hDirk Hockemeyer, et al., "Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases", Nature Biotechnology, 7 July 2011, doi:10.1038/nbt.1927. |
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