请高手指点一下，不胜感激

black

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5 |8 D. B5 ^+ l9 k
7 j0 p8 L- G( x我是按照10的6次方种的细胞，镜下观察已经是密密麻麻的了，如果再增加一倍体积的话，细胞会不会太密而影响生长啊？

1301918986

恩，我觉得应该是密度不够

luoziwei

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, u5 i" L3 ]8 Q5 y0 h5 T1 c" ^, I- V1 C6 Y9 o6 F7 |
如果是2、3天后贴壁变成密密麻麻的话，那就没必要增加体积。否则还是要加大密度的，骨髓液里面包含大量的杂细胞，如脂肪粒，3种血细胞，或者破骨细胞等等。你想一下啊，10的6次方接种的话，按照0.01%的比例算算，1ml也就才100个MSC啊。

black

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% `% B, i, s: ^2 ^  C5 k+ Z
这是首次换液三天后的照片，已经培养第9天了，请各位高手帮忙看一下是怎么回事？" V* j+ ]6 }. @2 a; s; W, i
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这是另外一瓶的样子，请问是什么原因造成这样的？
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! a4 O+ t" k  Q: N5 ?这是另外一瓶的样子，请问是什么原因造成这样的？9 k# Y- {% }+ }2 k/ E

仁心-妙术

干细胞原代培养难度大（1）细胞密度难以控制，杂质细胞数目多，纯化困难（2）合理控制血清浓度，避免发生老化（3）换液时间，需要一定经验。密度大了换液要勤，密度小时间可以延长（4）细胞活性相对细胞数目对细胞增殖的影响更大----个人经验：处于对数期的细胞，增殖能力很强，未消化的细胞哪怕是十几个也可以长满瓶子。老化的细胞即使达到70-80%融合，也很难增殖，甚至凋亡。（5）细胞融合是指局部的克隆而不是相对整个瓶底面积，局部长满80-90%就要传代。不要放弃，我原代的细胞数目也很少，10天了才长出几十个，但扩增的非常快。

black

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) {& A7 b7 ~; X$ j, s/ u8 N9 H, `" J+ Y) H" N7 M2 f& y
请问你原代一般养多少天开始传代？

仁心-妙术

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7 R& g8 Y% h8 _8 I
  z5 R4 Q- ~. [' x% @7 k$ {原代长到80%-90%融合就可以传代，时间与血清浓度、细胞密度有关，我用了大约20天（担心细胞长不出来，血清浓度偏高所以速度较快），我实验室另一位的原代用了一个月。

chengde266

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& W6 r4 y" x; u杂细胞在以后的换液和传代的过程中可以慢慢去掉。& \$ F" K+ T5 K, ^0 G# D
但是首次换液24小时，我们没有做过，都是三天左右。我觉得，细胞贴壁、增殖都需要一个合适的细胞密度。" J; ?1 @' T+ [' W+ n
你可以试试，三天半量换液，把弃掉的培养液再种瓶，你会发现还是有干细胞长出。

wangweilie0418

            骨髓中的MSC量本来不是很多，首先要保证足够量的骨髓，我们做人骨髓的一般会取80至90ml，再就是提取的过程，吸取白膜层时不要吸入过多的分离液，这样会使细胞的纯度降低。首次换液时24h换液是没有问题的，原代培养生长速度慢，我们的一般十天左右传代，所以你再看看吧！