请高手指点一下，不胜感激

black

回复 luoziwei 的帖子( |1 S$ q# s" T3 e2 F8 ?1 K: R

% ?5 A) w; [  ?# x3 p% s我是按照10的6次方种的细胞，镜下观察已经是密密麻麻的了，如果再增加一倍体积的话，细胞会不会太密而影响生长啊？

1301918986

恩，我觉得应该是密度不够

luoziwei

回复 black 的帖子
/ c, o( F! |' T: V% b, u1 u5 y
1 P9 r! R6 ^( ?( R如果是2、3天后贴壁变成密密麻麻的话，那就没必要增加体积。否则还是要加大密度的，骨髓液里面包含大量的杂细胞，如脂肪粒，3种血细胞，或者破骨细胞等等。你想一下啊，10的6次方接种的话，按照0.01%的比例算算，1ml也就才100个MSC啊。

black

# ]8 e' I5 a7 h% A9 E' J! Y) `) \
( P0 I6 J2 [, n4 D: |: A
这是首次换液三天后的照片，已经培养第9天了，请各位高手帮忙看一下是怎么回事？
' w7 ^9 K5 `( K% B, I3 o1 _! ~, }! n! N1 J) O" i+ z
这是另外一瓶的样子，请问是什么原因造成这样的？  ^/ f" x, V: c$ l  H1 }: j+ O5 @
- P) E+ C- y" s1 C$ O
这是另外一瓶的样子，请问是什么原因造成这样的？
2 N6 Y' O" r2 w4 H; N

仁心-妙术

干细胞原代培养难度大（1）细胞密度难以控制，杂质细胞数目多，纯化困难（2）合理控制血清浓度，避免发生老化（3）换液时间，需要一定经验。密度大了换液要勤，密度小时间可以延长（4）细胞活性相对细胞数目对细胞增殖的影响更大----个人经验：处于对数期的细胞，增殖能力很强，未消化的细胞哪怕是十几个也可以长满瓶子。老化的细胞即使达到70-80%融合，也很难增殖，甚至凋亡。（5）细胞融合是指局部的克隆而不是相对整个瓶底面积，局部长满80-90%就要传代。不要放弃，我原代的细胞数目也很少，10天了才长出几十个，但扩增的非常快。

black

回复 仁心-妙术 的帖子
- u. l# M5 q0 P: k2 M* {7 j+ X) ]$ b- O
请问你原代一般养多少天开始传代？

仁心-妙术

回复 black 的帖子$ a) T6 t, Z! N0 h! P
( k. {5 ~" C  @! f1 P/ c+ q
原代长到80%-90%融合就可以传代，时间与血清浓度、细胞密度有关，我用了大约20天（担心细胞长不出来，血清浓度偏高所以速度较快），我实验室另一位的原代用了一个月。

chengde266

回复 black 的帖子
9 ^( A- j; J* ]* ^5 T" W- }
9 V! B* |* i* Z* {杂细胞在以后的换液和传代的过程中可以慢慢去掉。
$ O% _( N4 h1 L  z, ^, V' V但是首次换液24小时，我们没有做过，都是三天左右。我觉得，细胞贴壁、增殖都需要一个合适的细胞密度。
$ f: a/ _' L$ r9 C9 W' @你可以试试，三天半量换液，把弃掉的培养液再种瓶，你会发现还是有干细胞长出。

wangweilie0418

            骨髓中的MSC量本来不是很多，首先要保证足够量的骨髓，我们做人骨髓的一般会取80至90ml，再就是提取的过程，吸取白膜层时不要吸入过多的分离液，这样会使细胞的纯度降低。首次换液时24h换液是没有问题的，原代培养生长速度慢，我们的一般十天左右传代，所以你再看看吧！