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楼主: black
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发表于 2011-8-19 09:53 |只看该作者
回复 luoziwei 的帖子
5 |8 D. B5 ^+ l9 k
7 j0 p8 L- G( x我是按照10的6次方种的细胞,镜下观察已经是密密麻麻的了,如果再增加一倍体积的话,细胞会不会太密而影响生长啊?
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发表于 2011-8-19 14:25 |只看该作者
恩,我觉得应该是密度不够
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发表于 2011-8-20 10:41 |只看该作者
回复 black 的帖子
, u5 i" L3 ]8 Q5 y0 h5 T1 c" ^, I- V1 C6 Y9 o6 F7 |
如果是2、3天后贴壁变成密密麻麻的话,那就没必要增加体积。否则还是要加大密度的,骨髓液里面包含大量的杂细胞,如脂肪粒,3种血细胞,或者破骨细胞等等。你想一下啊,10的6次方接种的话,按照0.01%的比例算算,1ml也就才100个MSC啊。
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发表于 2011-8-20 11:18 |只看该作者
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本帖最后由 black 于 2011-8-20 11:28 编辑 5 \# J, `) _$ v& t. \
% `% B, i, s: ^2 ^  C5 k+ Z
这是首次换液三天后的照片,已经培养第9天了,请各位高手帮忙看一下是怎么回事?" V* j+ ]6 }. @2 a; s; W, i
: u6 G( ~: d* S# i# U# ^
这是另外一瓶的样子,请问是什么原因造成这样的?
5 u2 v/ C7 B, D
! a4 O+ t" k  Q: N5 ?这是另外一瓶的样子,请问是什么原因造成这样的?9 k# Y- {% }+ }2 k/ E
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发表于 2011-8-20 15:22 |只看该作者
干细胞原代培养难度大(1)细胞密度难以控制,杂质细胞数目多,纯化困难(2)合理控制血清浓度,避免发生老化(3)换液时间,需要一定经验。密度大了换液要勤,密度小时间可以延长(4)细胞活性相对细胞数目对细胞增殖的影响更大----个人经验:处于对数期的细胞,增殖能力很强,未消化的细胞哪怕是十几个也可以长满瓶子。老化的细胞即使达到70-80%融合,也很难增殖,甚至凋亡。(5)细胞融合是指局部的克隆而不是相对整个瓶底面积,局部长满80-90%就要传代。不要放弃,我原代的细胞数目也很少,10天了才长出几十个,但扩增的非常快。
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发表于 2011-8-20 17:34 |只看该作者
回复 仁心-妙术 的帖子
) {& A7 b7 ~; X$ j, s/ u8 N9 H, `" J+ Y) H" N7 M2 f& y
请问你原代一般养多少天开始传代?

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发表于 2011-8-20 18:18 |只看该作者
回复 black 的帖子
7 R& g8 Y% h8 _8 I
  z5 R4 Q- ~. [' x% @7 k$ {原代长到80%-90%融合就可以传代,时间与血清浓度、细胞密度有关,我用了大约20天(担心细胞长不出来,血清浓度偏高所以速度较快),我实验室另一位的原代用了一个月。
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发表于 2011-8-31 10:44 |只看该作者
回复 black 的帖子
( s3 g  D! [9 |6 X! d9 [+ z
& W6 r4 y" x; u杂细胞在以后的换液和传代的过程中可以慢慢去掉。& \$ F" K+ T5 K, ^0 G# D
但是首次换液24小时,我们没有做过,都是三天左右。我觉得,细胞贴壁、增殖都需要一个合适的细胞密度。" J; ?1 @' T+ [' W+ n
你可以试试,三天半量换液,把弃掉的培养液再种瓶,你会发现还是有干细胞长出。
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发表于 2011-9-3 08:59 |只看该作者
            骨髓中的MSC量本来不是很多,首先要保证足够量的骨髓,我们做人骨髓的一般会取80至90ml,再就是提取的过程,吸取白膜层时不要吸入过多的分离液,这样会使细胞的纯度降低。首次换液时24h换液是没有问题的,原代培养生长速度慢,我们的一般十天左右传代,所以你再看看吧!
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