关于双酶切

huangcong1988

提了质粒之后测了测浓度，虽然不高（大概两三百），但是应该还能用，就双酶切，但是最后跑胶发现除了marker，就没有带了，不知道为什么，按理说即使没切开，也应该有带才对啊？很奇怪，两三百纳克每微升应该还是有比较亮的带吧？点了也不少（4微升）

zzc2211

质粒提取后，可以测浓度，个人认为最为保险的是跑胶鉴定，建议楼主在双酶切前先跑胶看一看质粒有无，确定有质粒后再双酶切。提取的质粒可受到蛋白、RNA等物质的污染，也可能就没有。测浓度时，DNA、RNA的最大吸收波长260nm，蛋白质280nm，残存的盐和小分子杂质230nm。OD260/280值估计核酸纯度，纯净DNA260/280比值约为1.8（大于1.9表明有RNA污染，小于1.6有蛋白质和酚污染），OD260/230估计去盐程度。OD260/230应大于2，OD260/230小于2说明去盐不充分，可再次沉淀和70%乙醇洗涤。纯RNA OD260/280值在1.7～2.0，小于1.7有蛋白或酚污染；大于2.0有异硫氰酸残存。2月前个人曾碰到同样问题，跑胶验证后质粒非常少。希望有所帮助。

zzc2211

质粒提取后，可以测浓度，个人认为最为保险的是跑胶鉴定，建议楼主在双酶切前先跑胶看一看质粒有无，确定有质粒后再双酶切。提取的质粒可受到蛋白、RNA等物质的污染，也可能就没有。测浓度时，DNA、RNA的最大吸收波长260nm，蛋白质280nm，残存的盐和小分子杂质230nm。OD260/280值估计核酸纯度，纯净DNA260/280比值约为1.8（大于1.9表明有RNA污染，小于1.6有蛋白质和酚污染），OD260/230估计去盐程度。OD260/230应大于2，OD260/230小于2说明去盐不充分，可再次沉淀和70%乙醇洗涤。纯RNA OD260/280值在1.7～2.0，小于1.7有蛋白或酚污染；大于2.0有异硫氰酸残存。2月前个人曾碰到同样问题，跑胶验证后质粒非常少。希望有所帮助。

like_gj

用提的质粒加loading直接点样做对照

wang3033

1.内切酶的质量如何？是否酶加的太多，可能酶产生了*活性，导致质粒被水解3 a5 q% b. L+ B4 @; ^+ ~6 {: @0 k
2.你的质粒是否是PET系列的，该类质粒本身就是低拷贝质粒; [: X! B- j0 `# K
3.内切酶选的对否，是否在MCS外还有酶切位点？' o6 L# Y& `% S. q2 {' d
4.内切酶作用时间不要太长，差一点的内切酶过夜消化经常效果不好

huangcong1988

回复 wang3033 的帖子2 b. B% }$ I  M5 P
, Z; \; J4 l) U3 s; R$ [. T  p
谢谢，感觉第二种推测有可能，不过转化的效果就不太好，可能那也有影响

huangcong1988

回复 like_gj 的帖子
8 m5 ]7 [- N& N3 p
# N% {  G) G; M/ G1 @# O正准备这么做呢，呵呵，不过即使没有切开，也应该有带才对，挺奇怪的

huangcong1988

回复 zzc2211 的帖子
6 ~$ ~9 N  a% Y& o& r% a! o1 p- V- P; y" J; v
谢谢，我测了浓度，三百多，OD比值也很正常，1.9左右，但还是没带，准备直接质粒加loading buffer 跑一下看看

zzc2211

回复 huangcong1988 的帖子7 d# @+ i( _" p8 i
. U" M* c, u2 J( z4 I0 d$ [% A
有结果告诉我一声，谢谢，共同进步

huangcong1988

回复 zzc2211 的帖子
0 \' {) Z8 P$ [+ c% v
- O0 K* u- v9 d1 y7 c/ y3 _  I我又做了一遍，浓度是1000左右，就是1微克每微升，比较高，但发现还是没带，提的质粒也没带，这个。。。