帮忙看看我养的mESC怎么样？

dilal

以前都是无饲养层培养的mESC，最近状态不好调整为饲养层培养了。大家帮忙看看我的mESC怎么样？
5 A0 a- u, u& p4 M图1：KSR培养基+feeder培养，传代后2天，×10倍镜9 R" n) ^0 E$ e9 D
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图2：FBS培养基+feeder培养，传代后1天，×4倍镜
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3 a- m. R# R1 W( e2 R5 @: P8 M, R图3：FBS培养基+feeder培养，传代后1天，×10倍镜9 [. f5 P  I. \' a

5 b' H- Q, k6 L请大家帮忙看看细胞分化明不明显，多不多？饲养层状态如何，密度合不合适？mESC接种密度是否合适，需要如何改进？

meiying3061

分化的不多，属正常，貌似你的feeder挺密的，mESC的密度可以的，克隆的状态也不错哦
1 [7 g* @- H4 J- d9 N+ k+ O/ z1 |/ l我想请问lz你的无饲养层是怎么养的啊，我为什么以转移到无饲养层就分化了呢，能不能告诉我你的无饲养层的培养方法呢，谢谢

dilal

回复 meiying3061 的帖子2 [) X* {! S/ E! A1 X# q" S
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恩，我也觉得feeder比较密，感觉MEF处理以后还在生长，目前已经延长了处理时间到1.5h。请问一下你一般feeder接种密度多大？1 C" E3 P$ d# t. ]
无饲养层培养要看你是那种小鼠胚胎干细胞系，我们的是CGR8系，已明确可以无饲养层培养。但是有的细胞系是不能无饲养层培养的，你最好先查一下有无相关报道。无饲养层培养方法就是：先用0.1%明胶铺板，然后接种mESC，加入和饲养层培养等量的LIF（也可以加大量），其他和饲养层培养条件一样。但是这种培养模式不能长期培养，容易分化，而且细胞集落形态较饲养层培养要差。有啥问题，可继续交流。

meiying3061

我的feeder也就是你现在密度的三分之一或者二分之一，小鼠的mESCfeeder密度不宜太密的，只要能够融合就可以。
0 W( D3 G! A4 u% g* V我养的细胞系是D3 cell line ，我曾尝试收集条件培养基然后再补加等量LIF，但是贴壁24h后再观察，分化也很严重，挺崩溃的，下面是拍的照片，麻烦帮我看看

dilal

回复 meiying3061 的帖子7 S% `$ C2 W* L% L" Q! z" ]
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的确是分化挺严重的，感觉你的细胞密度有些大，有细胞融合的迹象，适量缩小一下密度。另外你用的是血清还是血清替代物培养的？是否是干细胞专用的？
- `) i0 Q" s# v! z! `) J" M你有没有铺明胶，不铺明胶的话也很容易分化。另外你收集条件培养基是如何收集的？D3细胞系你是否看到文献中有报道用无饲养层培养？期待更多信息。

meiying3061

文献中有用无feeder的，但是 比较少，基本还是有饲养层的；1 u9 {& ]' b, }: b5 n: B) c$ v
明胶我铺的，是millipore的液体500毫升包装的；
: ]9 q1 |/ \, C( }血清是gibco的干细胞级胎牛，质量都是很好的；
' x2 o2 l( o$ |+ U5 \% `" A) V. ~条件培养基是常规铺好饲养层细胞，第二天换成干细胞培养液，隔天开始收集培养基上清，可以收5天；' L# W% G( D* G0 R1 \: H, _: X
细胞融合可能是我吹的不太匀的缘故，我一般不太敢太用力吹，怕把细胞吹的状态不好，是不是应该吹的次数再多点，直到成为单细胞为止？
5 J% G+ `) E. k% p) b/ D: P3 ^2 Q; m2 _非常感谢您的答疑

shangchunhua

根据我的经验，MEF的条件培养基分泌的LIF很少

zz091115

弱弱的问一句 这个feeder和LIF以及饲养层是个什么概念

dilal

回复 meiying3061 的帖子
/ l4 K( X2 U! `* K- F4 t; @6 }6 M, f& [6 l; @7 Z/ ?; w7 Z
Gibco干细胞级胎牛血清是不是新西兰、澳大利亚的？如果不是，可能有问题，目前中国由于疯牛病，禁止从北美、欧洲等地方进口血清。, J6 H! L% v. j, e! \* ]% ^
mESC是最好要吹打成单细胞悬液，如果成团的话接种后容易分化，刚好和hESC不同。看你的准备工作都做得很完备，另外收集后的培养液需要补充谷氨酰胺、非必需氨基酸、巯基丙醇，不知道你补充了没有。建议你尝试一下用50%的条件培养液+50%ESC培养液养养，期待你的好消息。

meiying3061

我用的时候是50%的CM加50%的ES培养液的，也补加LIF 的，所以我实在想不出还有什么办法了。
, I0 I+ b6 t" L) ^) b$ }2 M& T我是打算用无滋养层细胞做MTT 的，一个多月了也没做起来，哎。。。3 N3 O0 B1 t# p* \
胎牛估计是新西兰或者澳大利亚的，供应商没跟我们说3 Z* t' y  i  P
非常感谢你的帮助，我会再试试的，谢谢！