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由于实验需要,打算从刚出生不久的小鼠(PD3-PD14)卵巢中分离卵母细胞,向大家请教一下分离方法,下面是我看文献整理的一些步骤,感觉所需时间较长,大家有没有其他的更为有效的方法?望不吝赐教,谢谢。
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/ o: h$ ?' d0 D4 q7 i1 小鼠脱颈处死,取出卵巢,在显微镜下剔除脂肪垫和多余组织。# a2 e [" \1 k
2 将卵巢剪碎,然后胶原酶消化,消化过程中不断吹打振动。
# a' @1 I8 M0 J& R, [9 L 胶原酶溶于DMEM/F12培养基中,浓度为0.05%,培养基添加0.4%(g/ml)的BSA,100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素,
" ?& c" j/ @( A! Q+ Y* w3 大约40-60min以后,待组织消化基本完全,往消化液中加入EDTA至终浓度为40mM,然后于37℃孵育15-20min,期间不时搅拌,直到颗粒细胞以及其他细胞类型完全散开。1 b+ Y5 d, a0 N$ L0 l( ?
4 将细胞混合液洗涤一次,然后于上述不加血清的DMEM/F12培养基中培养12h,使颗粒细胞和其他细胞贴壁生长,未贴壁的卵母细胞和血细胞被聚集到上清液中,室温1000rpm离心5min,然后血红细胞经过低渗buffer出去,(含144mM NH4Cl和17Mm Tris-HCl Ph=7.2)。7 Y& Z* E' I i3 S1 ?/ e
5 洗涤几遍以后,离心收集卵母细胞,加入裂解液裂解后,14 000rpm 离心20min,4℃,取上清测BCA法蛋白浓度,待用。( ^9 F; ^1 Y8 n$ x, Y* N+ h
2 U, @+ V* G1 `5 ^ 具体方法参见: Pradeep Reddy, et al. Science,20080 K( E. [ G8 T
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