通过支架结构控制干细胞形态从而控制它的分化途径

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通过支架结构控制干细胞形态从而控制它的分化途径

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naturalkillerce导语：通过改变支架结构从而改变干细胞形态，然后利用干细胞形态控制干细胞分化途径，产生所需的分化细胞，而在这一过程中除了所需的细胞生长培养基外，还不用添加生物化学添加剂，从而可以避免加入生物化学添加剂可能带来的副作用，另外如果该方法最终成熟应用于实际的话，将会要比现有加入生物化学添加剂的方法更简单、更便宜和更安全，只是就目前而言，尚有很大一段距离，希望能早日应用实际，造福百姓。另外，文中对一些支架结构用不同颜色区别，同一种颜色代表同一种支架结构，不同颜色代表不同支架结构，可以看出总共有5种支架结构。现根据相关英文资源，编译如下：
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研究背景：
' }: v9 l( V4 z# g* }: E3 g" Z人原代骨髓基质细胞(primary human bone marrow stromal cells, hBMSCs)是一种成体干细胞，能够从骨髓中分离出来，而且能够依据不同条件分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。但是“依据哪些条件？”是组织工程学中关键性问题之一。另外，如何才能确保干细胞分化为人们所需要的细胞类型？人们可以采取不同办法：
4 n4 a" ~! {% t; p0 U& C第一种方法：人们已经知道要想让hBMSC分化为特定细胞类型，可以加入一些合适的添加剂，若要分化为骨细胞，则需加入成骨添加剂(osteogenic supplements, OS)。5 o; D& L! m! L5 N; P
第二种方法：其他研究则暗示人们能够通过装饰表面从而限制生长中的细胞能够附着的位置来控制干细胞在平直表面上的分化。
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+ B  S5 N2 O! R% O  G; j; J研究成果：4 U. w; [$ e/ r4 _
根据20世纪初期建筑师的格言“形状追随功能(Form follows function)”，来自美国标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology, NIST)的一个研究小组最近证实人们只需通过控制干细胞的形状就能够诱导它们分化为特定的细胞类型。该研究成果于2011年9月3日在线发表在《生物材料》杂志上。
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研究小组据信是第一次对5种流行的组织支架设计同时进行比较，除了细胞生长所需的培养基外，不加入任何生物化学添加剂，以便单独考核支架结构对这些骨髓细胞的影响。这些支架是由一种生物相容性聚合物聚己酸内酯(polycaprolactone, PCL)或聚内消旋乳酸(Poly-DL-lactic acid, PDLLA)组成，提供一种临时的埋入物以便给予细胞一种牢固结构，并在上面生长从而最终重建组织，为此研究人员选择采用浸出和发泡工艺制造出的5种三维结构不同的支架(有些虽然用不同材料组成，但是支架结构是一样)，即盐浸PCL支架(PCL Salt-leached scaffold, PCL_SL)、气泡沫PCL支架(Gas-foamed scaffold, PCL_GF)、气泡沫相分离PCL支架(Gas-foamed phase-separated scaffold, PCL_GFPS)、大纳米纤维PCL支架(PCL “Big” nanofiber scaffold, PCL_BNF，900nm)、小纳米纤维PCL支架(PCL_SNF，300nm)、大纳米纤维PDLLA支架(PDLLA_BNF，900nm)、自由形式构建的PCL支架(PCL Freeform fabricated scaffold, PCL_FFF)、二维旋涂PCL膜(2D Spin-coated PCL film, PCL_SC)和二维旋涂PDLL膜(PDLLA_SC)进行研究，其中二维平直结构 PCL_SC、PDLLA_SC和组织培养聚苯乙烯(Tissue Culture Polystyrene, TCPS)以及三维结构PDLLA_BNF用作对照。hBMSC在每个支架上进行培养，然后分析并观察哪种支架最有效地产生钙沉积---骨细胞活性的一个标记，同时也进行微阵列(microarray)分析以便确定培养细胞的基因表达谱。
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! Q3 w) G8 h+ r  N3 J成果之一：微阵列分析表明每种类型的支架结构诱导出特异性hBMSC基因表达标志。) N' V0 c+ H- }$ c

% o$ V# d# |. ]8 b* b- \& |+ c  X成果之二：层序聚类(hierarchical cluster)分析表明是按照支架结构而不是支架所用的聚合物化学性质对支架进行分类处理，这就意味着支架结构要比支架组成成分对hBMSC分化更有影响。1 C( Z& W. O" D/ S$ ^* h

9 |! m& B$ z3 Y' p成果之三：hBMSCs在纳米纤维支架中高效地分化为骨细胞---甚至没有加入任何成骨添加剂---但是在其他支架结构上则不是如此。这种差异产生的原因似乎是形状。成熟的骨细胞典型地长和富含几个延伸性分支。在这5种不同的支架当中，事实上只有纳米纤维能够迫使hBMSCs在试图找到锚定点时变成类似的长长的且有分支的形状。变成骨细胞的形状似乎能够诱导hBMSCs激活一些基因，并最终产生骨组织。hBMSCs在平直聚合物膜(即PCL_SC和PDLLA_SC)上培养时，在成骨添加剂存在下，也能观察到同样的形态，但是若没有加入成骨添加剂，则观察到更圆的但分支较少的形态。
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4 {! m" r9 n. }" n, x总结：这一切都意味着hBMSCs对支架结构要比想象中敏感得多，人们可以通过调整支架结构使之最优化，以便更好地迫使hBMSCs转变形态从而指导它们分化为所需的细胞系。1 h! w8 w6 r+ {6 \8 W  y4 y2 U
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应用价值：1 o% g2 h9 g# h5 G$ F+ s! C
之一：组织工程学经常使用某种形式的干细胞来试图修复或重生受损的身体组织。干细胞是体内的基本修复单元，有能力转变为几种不同形状中的任何一种，这样人们就可以更换不同支架结构迫使干细胞转变为所需的形状从而使之分化为所需的细胞，且不需加入任何任何生物化学添加剂，从而可以避免加入生物化学添加剂带来的不良影响。8 a* d9 I, C, v" A5 }; ?4 h# `" j! C
之二：在未来设计支架使得细胞变成人们所想要的形状将会是一个好的策略，尽管这是一件艰难的任务，但是人们能够理解很多事情：细胞形态怎样影响细胞行为，以及怎样利用三维结构来控制细胞行为。  d/ E5 ?* K* T, l7 j" d, q
之三：尽管目前利用这种方法仍然在开展研究，但是能够潜在性地只通过形状在物理上指导细胞分化将要比加入生物化学添加剂更简单、更便宜，也更安全。, C8 ?3 v1 H/ Z: `0 A

4 }! ~1 h' T# ?9 V而其应用价值之处也正是其不足之处：* Q# b& W" c  X0 |6 Y8 i
疑问之一：支架结构改变在上面培养的细胞的形态这点好理解，但是干细胞形态如何影响细胞分化呢？
% t) O5 B% p5 M7 t个人理解：改变支架结构就是改变干细胞生长的微环境(niche)，从而激活干细胞某些基因表达，这点得到微阵列实验证实，其实这种效果就如同加入某些添加剂，只是改变支架结构如何通过胞外空间的变化将支架结构带来的外界信号传导到细胞核从而导致某些基因激活呢？这仍是一个谜。
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疑问之二：该方法仍然处于试验阶段，尚未正式进入实际应用。因此是否要比现有加入生物化学添加剂的方法更简单、更便宜和更安全，仍是未知数。4 H( M" g; x3 Q$ ^4 K
个人理解：这是人们经常会产生的疑问，即新发现或新技术实际应用效果到底如何？这点恐怕还需实践检验和技术进一步优化。
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疑问之三：设计一个合适的支架结构，意味着要从很多结构中进行筛选，而筛选结果就是让干细胞转变为要已分化细胞的形态，然后让形态来指导细胞分化。亦即支架结构→干细胞转变形态(转变为与所需细胞形态相似的形态)→细胞分化(产生所需细胞)。只是如果在筛选时，就已经花费太多精力和时间，哪里有加入生物化学添加剂来得快？另外，有没有一种指导方针，可以有目的去选择所需结构，若是随机地选择支架结构，也不太现实。6 |: H( n$ F- x; T

$ [3 i3 \6 Q+ F) Z# Z4 P疑问之四：那么如果选择支架结构，即除了纳米纤维支架之外的结构，hBMSCs的分化情况又如何？是不是分化为其他类型的细胞，还是分化的细胞类型是一个细胞混合物，即含有脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞，或者只是其中两种细胞的结合。另外如果要分化成脂肪细胞，或者软骨细胞，那么又该选择什么支架结构呢？
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在纳米纤维支架上骨类似细胞生长：共聚焦显微图片详细描述了一个人骨髓基质细胞在纳米纤维支架(绿色)上的生长(在细胞骨架上肌动蛋白丝染色成橙色)。薄纤维结构促进干细胞发育成长长的且有带有分支的形状，而这种形状也成熟骨细胞的特征(Credit: Tison, Simon/NIST)。
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. u( k7 a% k) m, E( X致谢：编译时参见了sunsong7帖子http://www.stemcell8.cn/thread-46257-1-1.html上的英文新闻，并借用上面的图片，在此表示感谢，另外本文还参见了该研究成果发表在《生物材料》杂志上的论文摘要和正文框架。
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发表在《生物材料》杂志上论文信息：7 k+ B# Q: I- y+ |) Q
Girish Kumar, Christopher K. Tison, Kaushik Chatterjee, P. Scott Pine, Jennifer H. McDaniel, Marc L. Salit, Marian F. Young, Carl G. Simon. The determination of stem cell fate by 3D scaffold structures through the control of cell shape. Biomaterials, 2011; DOI:10.1016/j.biomaterials.2011.08.054，http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S0142961211010027
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+ c% R0 j8 s6 L$ @$ P5 [/ K原始文献见第9楼。

tpwang

回复 naturalkillerce 的帖子8 G% V  q4 t9 O6 ^) c# c) a
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Good summary and thoughtful comments.  \  Q2 l! }( b4 `/ E. }1 C* B: ^$ |

. b8 m2 v+ ?3 x关于材料与细胞之间的关系，无论什么材料，关键在于“微观”水平的交互作用机制。目前的大部分思路是在选取合适的材料以及利用这些材料本身的物理特性上。但感觉这是一个相对被动的try and error过程，还不是精确“控制”微观互动。看到一个工程概念：microfluidics，有人用于干细胞过程的微观控制，挺有意思。据说可以在任何水平上精确研究干细胞的行为。比如可以用于纯化干细胞等。自然，对cell-matrix互动的研究与控制也非常有用。MIT有人在做这方面的研究和应用。
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干细胞尤其是组织工程路线，到一定程度就成了一个工程控制问题。必要水平的微观控制可以保证细胞行为的精确把握，建立在这种精确微观把握基础上的宏观扩充（scale-up），就成了理想的制造（manufacture）流程。当然，说是个工程控制问题，难的是控制的对象是活的生物结构。再微观的工程技术，还是要针对远为复杂的生物动态结构和功能。) ?  E6 s, J, H+ g. O0 a
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tjbone

先谢谢了领导@@@@@@

naturalkillerce

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回复 tpwang 的帖子* L% [  ]# |3 U8 `
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确实如此，要scale-up，只有理解支架结构如何影响干细胞形态，从而影响干细胞中哪些基因表达，从而影响最终的分化途径，这种微观作用机制确实很重要，这样人们才可以体外模拟体内影响干细胞分化的微环境，不然仓促scale-up有可能出问题的。
9 Y: B0 K1 B4 A) u7 p" W; d至于microfluidics，即微流体技术，最近的确挺热门的，好多领域都通过控制微量样品实现精确控制。我准备找篇与干细胞相关的微流体方面的paper先瞧瞧。

sunsong7

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老狼以为“scale-up”不是问题的关键，支架结构研究的目标并非三维细胞体外大规模扩增，而是作为“补丁”乃至“无细胞补丁（cell-free patch）”植入体内进行组织修复（如骨修复及心脏修复），支架材料本身的规模化制造工艺不应该成为该项技术的瓶颈；

naturalkillerce

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: ], ^6 n7 {  E% _- U, D: h7 |另一种思维啊，即直接利用特定支架植入体内，但是这些支架如果是用生物相容性聚合物材料，在体内植入，如何把握一个适度的量，植入太少，容易降解，植入过多，会不会导致干细胞分化太多，如何控制呢？
! N( N, ?! m/ j! B6 l另外，体内植入跟在外面支架上培养，微环境环境差异还是比较大的，如何确保体内也能按照实现设定的程序进行分化而不走样呢？

sunsong7

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5 I- b- R+ Q5 R这里的确涉及一些具体的技术细节，据了解“镁基骨水泥”、“骨修复细胞外基质”、及“心脏补丁”等技术已经问世；据朋友介绍，植入后随着组织自行修复，骨水泥自然降解；4 p" v3 U$ R3 F0 }1 j: [% N+ S: _
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【扩展阅读】
4 {4 Q* ~1 c) J& X! N组织工程突破：给心脏打补丁令其自我修复 http://www.stemcell8.cn/thread-39519-1-1.html
: C# [# Q3 c3 z# y" |7 G骨髓干细胞和新型骨胶原制胶水粘合腿骨拼接 http://www.stemcell8.cn/thread-33851-1-1.html) O2 I. n7 c: p6 Y
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wanghuantjmu

大开眼界。前辈们的讨论让人耳目一新。

naturalkillerce

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回复 naturalkillerce 的帖子$ @- m  {- K* M' T4 ]3 }0 T

2 Q/ ^, H" P* T0 m4 k原始文献：
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+ c+ W) L/ C4 ]3 G$ q# p而该文献的补充材料参见帖子：http://www.stemcell8.cn/thread-47533-1-1.html

apollowanghai

可不可以解释一下层序聚类分析，和微阵列分析的原理啊？