成熟脂肪细胞培养

biocyclin

最近刚开始接触大鼠脂肪细胞培养（成熟脂肪细胞与脂肪基质细胞），一直不是很好，高手能否指点下

细胞海洋

请详细说明你的实验问题 大家才能帮你找问题

biocyclin

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# }2 M+ N  x" Y7 j
% _. h; y6 i* _) {$ I2 C就是成熟脂肪细胞用天花板法倒置培养过夜，贴壁的很少

lidaifu001

成熟脂肪组织，可以用消化法做，贴壁的还行，您可以试试。

anti

不知道你用的什么倒置培养方法。要是用培养瓶的话培养基是要充满培养瓶的只留大约2ML的空间加入成熟脂肪细胞。
" T: F( R& q0 J+ i+ j1 提取小鼠脂肪组织后先用生理盐水清洗干净，剔除血管，结缔组织等（有助于初步纯化细胞，后面步骤提取出的成熟脂肪细胞比例会比较大）。用剪刀剪碎，（细碎的组织有利于细胞爬出。）5 x5 A- c. e& L
2 用0.075% I型胶原酶37℃恒温摇床消化 1h，期间需反复震荡混匀。.; h' v5 w2 U' W3 ?6 p
3 等量体积的完全培养基(高糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗)中止消化。/ l% w  G. H# _' B" n2 K+ ~3 C  n3 s
4 消化后的匀浆用200微米的滤网过滤，去除块状脂肪组织和结缔。（成熟脂肪细胞体积较大，直径大约在100~200微米左右，在光镜下成发亮的球形）
, d0 N4 c; J3 K5 135g离心3min（成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，而处于离心管底部的是SVF）4 r5 X; k7 h  X1 {% J5 C1 ~
6 离心后去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，135g 3min离心。重复此过程数次。（进一步纯化）& Q* e2 L. a* j/ ^# ~' R, P
7 将清洗干净的脂肪细胞用完全培养基重悬，计数。6 b$ K, J' Q! }7 o5 i
8 接种密度 5×104/T25。/ x$ d5 I# R& H2 ~8 z' V
9 接种时培养基基本充满培养瓶。
7 I/ x" u  Z. @1 r' K10 倒置培养，最好选用没有透气膜的培养瓶，否则会漏液。" G% L  N, B3 x3 s$ c
11 一般10~14天去分化，期间不要换液，前几天细胞贴壁不牢时也不要触动培养瓶，防止刚贴壁的细胞脱落。
. M1 f& G0 r$ l, b6 g. s12 细胞贴壁后方可正放培养瓶，正常换液培养扩增。
3 p" {" F8 D' z2 w
) Z+ \9 h8 k7 A- h" j4 P, f

anti

如果对去分化脂肪细胞的纯度有很高要求，可以进行多次短期倒置培养提纯。
/ J; N+ E) u9 n& @与楼主共享几篇文献~
# @; ?' X) k% _希望楼主成功。

dzj121

回复 anti 的帖子8 u* L3 X6 E: p4 e0 t# h3 A
" |+ P5 {$ o+ I- b5 @) p% b% q
10-14天都可以不换液么？没气体交换怎么办？带滤膜的瓶子可以不漏液体的哇

anti

没事的如果你用带滤膜的就要用封口膜把口封好，不然一定会漏的。14天不换没有事，毕竟一个T25装满有将近70毫升的。再说了，你换的话也换不了，要不刚贴的细胞就会掉下来了。你要等它贴牢了再换。
; R5 x3 E! Y1 G6 F, K+ d

biocyclin

感谢，试试

biocyclin

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3 T; f9 |. ?: ]5 A! u
% {( ^  \) ^- A5 Z血清浓度是多少对实验影响大吗，我看有很多种浓度的，有的说20%，有的说10%，还有的说血清浓度高了，对细胞有影响，只用1%的