成熟脂肪细胞培养

biocyclin

最近刚开始接触大鼠脂肪细胞培养（成熟脂肪细胞与脂肪基质细胞），一直不是很好，高手能否指点下

细胞海洋

请详细说明你的实验问题 大家才能帮你找问题

biocyclin

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! j6 d# R0 f; U' R! }% b, }9 b" D1 ]8 H
就是成熟脂肪细胞用天花板法倒置培养过夜，贴壁的很少

lidaifu001

成熟脂肪组织，可以用消化法做，贴壁的还行，您可以试试。

anti

不知道你用的什么倒置培养方法。要是用培养瓶的话培养基是要充满培养瓶的只留大约2ML的空间加入成熟脂肪细胞。
9 M2 K3 H: e! r1 提取小鼠脂肪组织后先用生理盐水清洗干净，剔除血管，结缔组织等（有助于初步纯化细胞，后面步骤提取出的成熟脂肪细胞比例会比较大）。用剪刀剪碎，（细碎的组织有利于细胞爬出。）
, ]* M. Y( E! n2 用0.075% I型胶原酶37℃恒温摇床消化 1h，期间需反复震荡混匀。.$ Z* w6 |' p5 n7 Z0 Z
3 等量体积的完全培养基(高糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗)中止消化。
+ d- G/ M3 ]; K7 \- l. @4 消化后的匀浆用200微米的滤网过滤，去除块状脂肪组织和结缔。（成熟脂肪细胞体积较大，直径大约在100~200微米左右，在光镜下成发亮的球形）
6 \" I6 L! ~5 p8 H. t2 H5 135g离心3min（成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，而处于离心管底部的是SVF）* d+ T0 U6 q" u, w2 a0 J' b
6 离心后去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，135g 3min离心。重复此过程数次。（进一步纯化）
8 ^: a: T: |  d; V$ k7 将清洗干净的脂肪细胞用完全培养基重悬，计数。4 a8 Q% R1 K8 t0 f$ i
8 接种密度 5×104/T25。
2 \& `) Z  F' g. k3 T9 接种时培养基基本充满培养瓶。
2 q" q4 U5 G! `* Y10 倒置培养，最好选用没有透气膜的培养瓶，否则会漏液。' g. Q) w) C4 R  V  b
11 一般10~14天去分化，期间不要换液，前几天细胞贴壁不牢时也不要触动培养瓶，防止刚贴壁的细胞脱落。
0 V7 _& z  V# u! b12 细胞贴壁后方可正放培养瓶，正常换液培养扩增。
% Z; h) M2 ]: P* s. d2 t
/ G/ h, }! V" z) C1 |3 N$ b* C

anti

如果对去分化脂肪细胞的纯度有很高要求，可以进行多次短期倒置培养提纯。" _: U" k/ n* u3 h8 F7 G$ j1 l5 u
与楼主共享几篇文献~
4 d4 N1 W5 ^+ e3 S. o希望楼主成功。

dzj121

回复 anti 的帖子3 i2 m6 @; V6 J6 ]; ~6 E5 m

6 ?; t: d% |' n$ r: w" Q10-14天都可以不换液么？没气体交换怎么办？带滤膜的瓶子可以不漏液体的哇

anti

没事的如果你用带滤膜的就要用封口膜把口封好，不然一定会漏的。14天不换没有事，毕竟一个T25装满有将近70毫升的。再说了，你换的话也换不了，要不刚贴的细胞就会掉下来了。你要等它贴牢了再换。
- Z0 X3 ?3 Q) K; I) X4 y! c

biocyclin

感谢，试试

biocyclin

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5 j) }# b1 u& |6 h" P: W& e% x- i. _6 \/ ?) f5 f* X/ f& g6 M
血清浓度是多少对实验影响大吗，我看有很多种浓度的，有的说20%，有的说10%，还有的说血清浓度高了，对细胞有影响，只用1%的