成熟脂肪细胞培养

biocyclin

最近刚开始接触大鼠脂肪细胞培养（成熟脂肪细胞与脂肪基质细胞），一直不是很好，高手能否指点下

细胞海洋

请详细说明你的实验问题 大家才能帮你找问题

biocyclin

回复 细胞海洋 的帖子# V  E" [) B9 o( l9 S

! w9 i, B6 {* Z3 \0 n8 c就是成熟脂肪细胞用天花板法倒置培养过夜，贴壁的很少

lidaifu001

成熟脂肪组织，可以用消化法做，贴壁的还行，您可以试试。

anti

不知道你用的什么倒置培养方法。要是用培养瓶的话培养基是要充满培养瓶的只留大约2ML的空间加入成熟脂肪细胞。2 G7 G& F5 F& r4 v$ D" Z
1 提取小鼠脂肪组织后先用生理盐水清洗干净，剔除血管，结缔组织等（有助于初步纯化细胞，后面步骤提取出的成熟脂肪细胞比例会比较大）。用剪刀剪碎，（细碎的组织有利于细胞爬出。）
  C; Y. H$ |# H: _) z' a2 用0.075% I型胶原酶37℃恒温摇床消化 1h，期间需反复震荡混匀。.. x" \2 p8 p: w
3 等量体积的完全培养基(高糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗)中止消化。0 k. c* w3 s5 u
4 消化后的匀浆用200微米的滤网过滤，去除块状脂肪组织和结缔。（成熟脂肪细胞体积较大，直径大约在100~200微米左右，在光镜下成发亮的球形）
. D! T/ X# G: u  E5 135g离心3min（成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，而处于离心管底部的是SVF）; ^' K  r) `; }  U4 C
6 离心后去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，135g 3min离心。重复此过程数次。（进一步纯化）
  w; n) B& G; U5 V7 将清洗干净的脂肪细胞用完全培养基重悬，计数。
9 L$ y: d# D0 L' K+ [8 接种密度 5×104/T25。
' I# ^2 ]. O8 I6 I1 h9 接种时培养基基本充满培养瓶。
' Z; M8 @+ X) ^/ F: p10 倒置培养，最好选用没有透气膜的培养瓶，否则会漏液。
+ u+ u$ M- L* N! d11 一般10~14天去分化，期间不要换液，前几天细胞贴壁不牢时也不要触动培养瓶，防止刚贴壁的细胞脱落。. [- t6 W3 a# L6 d: k( c% d5 G& s
12 细胞贴壁后方可正放培养瓶，正常换液培养扩增。
* T' k. g2 s' Y8 ?( S
0 F  G5 x; F' ]. N

anti

如果对去分化脂肪细胞的纯度有很高要求，可以进行多次短期倒置培养提纯。
3 Y, g0 w# X' U5 j0 K$ e与楼主共享几篇文献~' u, R- I) Z# Z: ?6 S
希望楼主成功。

dzj121

回复 anti 的帖子
* J1 r: y( Z; i/ z" m7 R: S9 ^. e% x8 X
10-14天都可以不换液么？没气体交换怎么办？带滤膜的瓶子可以不漏液体的哇

anti

没事的如果你用带滤膜的就要用封口膜把口封好，不然一定会漏的。14天不换没有事，毕竟一个T25装满有将近70毫升的。再说了，你换的话也换不了，要不刚贴的细胞就会掉下来了。你要等它贴牢了再换。
8 ^& R* [1 k0 o/ ~. g- c

biocyclin

感谢，试试

biocyclin

回复 anti 的帖子' [& d4 v( A( O! ^
' b  v4 r: b8 X' k
血清浓度是多少对实验影响大吗，我看有很多种浓度的，有的说20%，有的说10%，还有的说血清浓度高了，对细胞有影响，只用1%的