关于反向PCR

yeya

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+ G/ g, V% g, |* n3 p) \- h不好意思，我记错了，我看了看以前的实验笔记，我和你一样先酶切基因组再自连成环，拿连接产物做PCR，也是要检测外源转座子插入到基因组的何处，通过gain-of-function或者loss-offunction的手段来获知位置基因的功能吧。我觉得你应该一步一步检查推敲寻找原因。首先，你提取到基因组后，时候跑胶检测过有没有含蛋白污染、纯度好不好，我记得我以前用一个比较烂的KIT抽genomicDNA然后reversePCR就不好，后来换了invitrogen的KIT结果挺不错。其次，基因组酶切后，是否有检查酶切图是否正确。酶切后是否灭活。再次，自连的条件时候合适，16度过夜连；最后自连DNA的提取是否合适，提取后对self-ligation的DNA定量看看时候正常；最后就是的inversePCR体系了，和我上面说过的一样，仔细检查。还有记得我说过的那个方法，要是出来smear那么把反应液直接胶回收，稀释后在inversePCR，这样肯定最后会有带，这个我也是从一个长做inversePCR的人的protocol那里学来的。P不出来就过段时间再P，还是那句话，有时候怎么P都是smear，再过段时间又好了。

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