请大家帮分析下内皮祖细胞提取失败的原因

ronain

从大鼠骨髓提取的，离心后白膜层总是不很清楚，试着更改离心参数，有一次清楚了，但细胞培养三四天了，还都是圆圆的，没有变化。怀疑细胞已经死了。可都是按照文献步骤操作的，用的淋巴分离液和培养基都是比较好的。可为什么总失败呢?希望大家能指点下迷津，谢谢。

千里草

首先内皮祖细胞含量较少，所以操作要更谨慎。1500-1800rpm离心后白膜层应该挺清楚的，吸取时要尽量洗干净，同时也不要吸入太多的淋巴细胞分离液，用进口的培养液接种后，避免晃动，培养3、4天时间太短，细胞还未发生明显的形态变化，建议1周时再观察并换液以去除未贴壁细胞。再尝试一下吧
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zz091115

1.从骨髓冲洗细胞是没冲干净 2.淋巴细胞分离液具体是什么玩意，比如Histopaque 后面有个数字是指密度，1083是给鼠用的，1077是给人用的，说明书上的离心给的单位是g，就是重力加速度，要根据你的离心机半径换算为转速，具体可以参考你离心机说明书，或是网上有个简易的换算表 3.培养瓶或是皿应该铺fibronectin，其实不铺也行，就是贴壁少点而已 4.种下去就不管了，不要看不要动，除非肉眼都能看出污染来，你可以96小时后换液，也可以48小时候将不贴壁的细胞转移到新的铺过fibronectin的培养瓶里，接种密度不要太小，虽说这玩意是接触抑制，但是也是密度依赖的 5.培养基就不用说了，最好用EGM-2 kit 6.通常不会是这个原因的原因，就是你的老鼠太老了，我一般用80-120克的老鼠 如果这样的话四天最多五天还没多少细胞贴壁，都是圆圆的漂着的，那就是失败了，不用等了，重做吧

ronain

谢谢各位的热心回复。* C$ S5 O9 i) G! M
还想问一下:细胞总养不活，是不是因为从大鼠死亡到细胞放入培养基，花费的时间太长了，对于提取用的时间有限制吗？还有就是那么多天不换液，细胞生长不会缺营养吗？3 f) R6 H# S2 M8 A" Z