hES冻存及复苏需要注意什么

zhusealin

冻存的hES复苏不成功，想问下大家hES一个T25瓶子一般可以冻存几管？冻存液要用90%的ES血清吗？一般复苏后多久能看到克隆？

meridian

没做过hES的冻存，但是我想我相信细胞冻存的原理基本上是一样的。主要是避开细胞内水分结冰导致的高渗环境对细胞的 一些功能单位造成难以恢复的损伤。以及形成的冰晶对细胞骨架造成的伤害。细胞冻存一般采用“慢冻快化”的原则，冻存时控制降温的速度。推荐使用“梯度降温冻存盒”。复苏时一定要快，高温条件下，我们一般采用的抗冻剂（DMSO）细胞毒性较强，低温是基本没有。同时注意复苏时要缓慢加入培养液，让细胞中的DMSO慢慢渗透到培养液中（一般10倍稀释），最后通过离心去除DMSO。DMSO推荐10%； FBS推荐40~50%；培养基50~40%。

牙牙丫丫123

建议你冻存和复苏时密度大一点，这样可能更好一点

ldy689689

冻存的密度大一点了，DMSO用20%，FBS用30%看看效果吧

ldy689689

冻存的密度大一点了，DMSO用20%，FBS用30%看看效果吧

举锅

没做过hES，不是很清楚hES长得大不大，不知道T25瓶长满了有多少但根据充质干细胞经验一瓶T175培养瓶若的话一般10的7次方左右，所以一个T25的瓶应该不会有太多吧，感觉一般冻存密度10的5-7次方比较好些，冻存前最好计下数，冻存时就用培养细胞的培养基以9:1对DMSO就好了，加DMSO时需要慢些，后遵循慢冻快融规则。

kastanie

HES的冻存，最好密度大一些。一个T25的瓶子能冻多少，是看你养的密度来说的，如果克隆比较多，比较密，那就可以多冻几支，如果很少那就千万不要多冻。一般我冻存时一个T25的瓶子，密度一般，就冻两支左右。复苏这个HES细胞，存活率很低的，要多观察一段时间。

cmmwql

复苏的次日起开始即需更换培养液，每天更换一次。6 X% n$ ~+ E0 m/ }, m3 k
复苏后第2-3天左右可以看见微小的克隆出现，之后逐渐长大。8 o, C- g8 p  p) H
复苏后第4-5天传代，具体情况视ES细胞生长情况而定。当生长至80%满时可以传
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3 ]! i! M5 I. ~4 I8 o- \当细胞生长良好时，消化细胞0 L7 i/ ]9 I6 g* H2 I9 x: B
将消化下的细胞洗涤两次。0 Z, B2 G2 W) l  p5 B
用2ml新鲜的小鼠胚胎干细胞培养基重悬细胞。* H0 w' N( P9 g" ^  G/ |5 f
离心后，吸弃上清。: [7 x+ ~  B/ B  u  P$ u4 {; n) F+ m: k$ X
加入0.25ml新鲜的小鼠胚胎干细胞培养基重悬细胞
0 G6 ~* @; C  w0 V; ~# ]1 C* m加入0.25ml小鼠胚胎干细胞冻存液（2x），快速混匀。9 K9 R: S6 w/ T( c. r( ?
将上述0.5ml细胞悬液转移至2ml冻存管中。
# @% D- Z/ t+ d! B2 r迅速将冻存管放入冻存盒中， -80℃冰箱过夜。8 ?* v: W- @8 }& U
最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。" D. D8 c( c  B: k9 [
, Q4 K8 V9 Q1 G
细胞冻存密度以1*106-7个细胞/ml为宜。" l1 `1 ]& ]' W3 F3 R6 g

czzhaozhu

我做hES细胞培养时，一个10cm的培养皿，待长5-6天融合达90%以上时即冻存，此时一皿可以冻大概10-12支麦管，因为能收到许多细胞；而复苏时，就是一支麦管复苏到一个10cm的皿中，第二天就能看到明显的ES集落。冻存液配方：10%DMSO,10%细胞悬液，80%血清替代品。

tigerfish

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$ v4 X9 h3 H, C8 u( b
我的做法：  k. o  x: {6 N
冻存：& n% c. I+ @. {1 u" N8 D* W
方法一：参见wicell官方protocol，
# K* d/ I2 x+ F" ?2x 冻存液成分：60% defined FBS+ 20%DMSO+正在用的20%ESC培养液，现配现用，你懂的
* h! \- {3 p+ D) B使用时，用1：1的ESC培养液混合，IPA冻存盒在-80C过夜，然后转液氮。
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8 y9 G2 n6 V- G- a4 A/ F/ i" b方法二：使用STEMCELL的品牌冻存液，mFreSR，即买即用，1x液体
& I9 Q& A+ O; X$ z' w使用方法类似。
0 ]) B" `, ?) k$ J& b
# \5 [/ @" |$ ]/ H* S我的做法是6孔板一个孔（80-90%满）放一个2ml冻存管。保证分化率<10%, 如果有大量分化，我建议现在显微镜下面挑掉分化的细胞。或者挑好的colony养养好再冻存。* t1 M: Y8 ]3 @) `2 }) a( ]) [+ X& Y
1mg/ml的collagenase IV消化15-20分钟（不超过20分钟），1ml collagenase IV / well， 拍打让colony整片脱落（重要！碎片如果太小复苏是成活率极低！！）
" r  z4 d" W5 n- Q: b用ESC培养液洗1-2次，加冻存液冷冻。- u! S$ K' E  W$ S9 ~

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解冻办法类似：9 `) y* c( f5 J3 J. \# q
预热培养液
7 q1 ?7 ~( Z$ G! V* f37C解冻细胞，用培养液洗1-2次，种在feeder layer上或者matriGel上（如果你用feeder free system）
" @- O6 F) Q/ }; U" _8 x" a一般来说复苏成活率只有10-15%，而且接下来几天会有大量死细胞，这是正常的！！不过，ESC你懂的，只要有1%活着，你今后就可以想要多少就有多少。3 X0 P1 @2 t$ K5 z0 Y7 Q* s
复苏的细胞一般要调理3-4代才能恢复往日风采，所以养ESC最好能一直养着，不建议常常冻存和解冻，伤细胞也浪费时间