请教一下关于肿瘤干细胞培养的问题，如何挑出干细胞球？

暮色英雄

我培养的一盘胶质瘤干细胞里面有很多死细胞，同时还存在着干细胞球，我想单独挑出干细胞球来培养，请问怎么才能挑出来呢？是用多大的枪，是不是需要在显微镜下面操作，如何保持无菌环境？谢谢了

genedu

我的建议：根据我个人经验来讲
6 F4 f! G' F+ _2 J) N1.如果有很多死细胞的话，可以挑取之前先换一下液
% U1 {) c; B  a; w$ b, `) G2.如果干细胞球比较小的话，可以现在细胞培养板子地下，用marker笔标记一下，如果比较大，肉眼可见，就不必; q/ i9 ~  F. A( d& I
3.挑取的时候是用显微镜，显微镜先用酒精擦拭，放进工作台后再紫外灭菌，假如需要长时间操作的话，显微镜最好别往外拿
7 Y, h: g  ~/ `4.准备好96孔板，其中放入适量（参考50ul）胰酶或其他酶准备消化用。准备24孔板，是消化后用来培养细胞的。) y( r& N& n6 N, B4 K9 g
5.用20ul的枪从细胞培养板中进行挑取，放入96孔板。消化一定时间后（参考5miin)，转入24孔板。
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暮色英雄

genedu 发表于 2011-11-16 13:42
# a; e: m# ~5 L+ b1 y2 b2 j+ m4 I我的建议：根据我个人经验来讲; \0 x+ m9 G! c" z7 N/ t' h& H
1.如果有很多死细胞的话，可以挑取之前先换一下液. b9 ?! O' V$ J. q/ h# w
2.如果干细胞球比较小的 ...

. ?8 Y* s4 G5 ], Q& ^9 @+ M# s干细胞球在显微镜下面看着都比较小，肉眼能看清楚吗？& z$ f6 a" n" C# i! D2 R5 v
另外为什么要用96孔板呢，挑出来的干细胞不能直接放到6孔板培养吗？而且我没有加血清的，还有必要用胰酶来消化吗？

genedu

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我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的，然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞球的话，时间比较长之后，他会长到肉眼可见。
! H, T" W2 X# }4 d( w/ k) q0 F一般来说，消化之后细胞变得比较散，这样更加利于他的传代培养，还有消化的时候，并不是一定得用胰酶，胰酶只是最普通的消化酶，比如在大鼠的ES上，用胰酶效果就不是很好。

暮色英雄

genedu 发表于 2011-11-16 14:06 / _% h$ T3 n5 C1 U* t$ W$ d
回复 暮色英雄 的帖子) @0 l' e# P& O6 ]3 @% C7 W. c

6 t" m3 Y: G- o我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的，然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞 ...

3 R3 `0 ]% Q  M嗯，还有一个问题，单独将干细胞球挑出来养是放在越小的孔里面养越好吗，比如用96孔板？

genedu

回复 暮色英雄 的帖子7 ~( ]+ l2 e. ^2 f& J8 i

" O; |# \5 B6 L4 k一般96孔板是用来消化的，细胞量比较少的时候24孔板就行，真正培养细胞的话96孔板忒小

小木梅

回复 genedu 的帖子! x! d8 ]1 p% C" q$ w, Y4 l7 P' C1 w
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我想请问一下  是不是一个96孔只挑一个球进去消化？在96孔里消化后直接移到24孔板里培养吗？这中间需不需要除去消化酶这一步骤？如何除去消化酶（50ul很少无法离心吧）？

genedu

回复 小木梅 的帖子7 o/ l# b: m& Q- W. O& `* U, g( U
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96孔板是只消化一个球，消化后直接移到24孔板，如果24孔板里面有血清就不需要去消化酶，如果没有的话，就先加2倍（100ul)中和，然后再放入24孔板

小木梅

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谢谢，我用的是无血清培养基，中和就可以了是吧？24孔板一般加多少培养液呢？种下去后多久换液？一般挑细胞球是原代培养或者细胞系第一次成球的时候才做吗？另外请教一下，挑出来的细胞球有没有必要做标记，比如球一号，球二号……以及其各球后代要不要区分开来？

genedu

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7 ~; M: {  K1 N0 h  w0 {; ^3 @无血清的就先在96孔板中和先，24孔板加1ml，第一次最好是24h换液，因为是有血清的；第一次成球就可以做，如果效果好的话；挑出来的球看你要干什么了；一般是看24孔板中那个球长得好，确定自己要用它来做下游实验的，才标记