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请教一下关于肿瘤干细胞培养的问题,如何挑出干细胞球? [复制链接]

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楼主
发表于 2011-11-16 12:55 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
我培养的一盘胶质瘤干细胞里面有很多死细胞,同时还存在着干细胞球,我想单独挑出干细胞球来培养,请问怎么才能挑出来呢?是用多大的枪,是不是需要在显微镜下面操作,如何保持无菌环境?谢谢了
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沙发
发表于 2011-11-16 13:42 |只看该作者
我的建议:根据我个人经验来讲
6 F4 f! G' F+ _2 J) N1.如果有很多死细胞的话,可以挑取之前先换一下液
% U1 {) c; B  a; w$ b, `) G2.如果干细胞球比较小的话,可以现在细胞培养板子地下,用marker笔标记一下,如果比较大,肉眼可见,就不必; q/ i9 ~  F. A( d& I
3.挑取的时候是用显微镜,显微镜先用酒精擦拭,放进工作台后再紫外灭菌,假如需要长时间操作的话,显微镜最好别往外拿
7 Y, h: g  ~/ `4.准备好96孔板,其中放入适量(参考50ul)胰酶或其他酶准备消化用。准备24孔板,是消化后用来培养细胞的。) y( r& N& n6 N, B4 K9 g
5.用20ul的枪从细胞培养板中进行挑取,放入96孔板。消化一定时间后(参考5miin),转入24孔板。
) W; h% F& \, g! I: }8 S
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藤椅
发表于 2011-11-16 13:53 |只看该作者
genedu 发表于 2011-11-16 13:42
# a; e: m# ~5 L+ b1 y2 b2 j+ m4 I我的建议:根据我个人经验来讲; \0 x+ m9 G! c" z7 N/ t' h& H
1.如果有很多死细胞的话,可以挑取之前先换一下液. b9 ?! O' V$ J. q/ h# w
2.如果干细胞球比较小的 ...

. ?8 Y* s4 G5 ], Q& ^9 @+ M# s干细胞球在显微镜下面看着都比较小,肉眼能看清楚吗?& z$ f6 a" n" C# i! D2 R5 v
另外为什么要用96孔板呢,挑出来的干细胞不能直接放到6孔板培养吗?而且我没有加血清的,还有必要用胰酶来消化吗?
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板凳
发表于 2011-11-16 14:06 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
回复 暮色英雄 的帖子
7 i1 p$ A  j+ D+ e8 e) t% [7 s6 J. p" [
我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的,然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞球的话,时间比较长之后,他会长到肉眼可见。
! H, T" W2 X# }4 d( w/ k) q0 F一般来说,消化之后细胞变得比较散,这样更加利于他的传代培养,还有消化的时候,并不是一定得用胰酶,胰酶只是最普通的消化酶,比如在大鼠的ES上,用胰酶效果就不是很好。
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报纸
发表于 2011-11-16 14:14 |只看该作者
genedu 发表于 2011-11-16 14:06 / _% h$ T3 n5 C1 U* t$ W$ d
回复 暮色英雄 的帖子) @0 l' e# P& O6 ]3 @% C7 W. c

6 t" m3 Y: G- o我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的,然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞 ...

3 R3 `0 ]% Q  M嗯,还有一个问题,单独将干细胞球挑出来养是放在越小的孔里面养越好吗,比如用96孔板?
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地板
发表于 2011-11-16 17:35 |只看该作者
回复 暮色英雄 的帖子7 ~( ]+ l2 e. ^2 f& J8 i

" O; |# \5 B6 L4 k一般96孔板是用来消化的,细胞量比较少的时候24孔板就行,真正培养细胞的话96孔板忒小
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发表于 2011-11-17 13:44 |只看该作者
回复 genedu 的帖子! x! d8 ]1 p% C" q$ w, Y4 l7 P' C1 w
; @+ p! w% A6 U) g
我想请问一下  是不是一个96孔只挑一个球进去消化?在96孔里消化后直接移到24孔板里培养吗?这中间需不需要除去消化酶这一步骤?如何除去消化酶(50ul很少无法离心吧)?
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发表于 2011-11-17 13:50 |只看该作者
回复 小木梅 的帖子7 o/ l# b: m& Q- W. O& `* U, g( U
' b0 O. x5 ~& O; L1 O% T% f% V: {
96孔板是只消化一个球,消化后直接移到24孔板,如果24孔板里面有血清就不需要去消化酶,如果没有的话,就先加2倍(100ul)中和,然后再放入24孔板
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发表于 2011-11-17 14:14 |只看该作者
回复 genedu 的帖子
2 g3 q8 j  `, ^* X# N) a4 o1 d5 m$ n% \8 n4 J
谢谢,我用的是无血清培养基,中和就可以了是吧?24孔板一般加多少培养液呢?种下去后多久换液?一般挑细胞球是原代培养或者细胞系第一次成球的时候才做吗?另外请教一下,挑出来的细胞球有没有必要做标记,比如球一号,球二号……以及其各球后代要不要区分开来?
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发表于 2011-11-17 14:45 |只看该作者
回复 小木梅 的帖子
" ^+ p, i$ S+ H) A
7 ~; M: {  K1 N0 h  w0 {; ^3 @无血清的就先在96孔板中和先,24孔板加1ml,第一次最好是24h换液,因为是有血清的;第一次成球就可以做,如果效果好的话;挑出来的球看你要干什么了;一般是看24孔板中那个球长得好,确定自己要用它来做下游实验的,才标记
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