请教一下关于肿瘤干细胞培养的问题，如何挑出干细胞球？

暮色英雄

我培养的一盘胶质瘤干细胞里面有很多死细胞，同时还存在着干细胞球，我想单独挑出干细胞球来培养，请问怎么才能挑出来呢？是用多大的枪，是不是需要在显微镜下面操作，如何保持无菌环境？谢谢了

genedu

我的建议：根据我个人经验来讲
" U& \: v  q8 \) ^1.如果有很多死细胞的话，可以挑取之前先换一下液$ n! h3 i# g# R) d/ i
2.如果干细胞球比较小的话，可以现在细胞培养板子地下，用marker笔标记一下，如果比较大，肉眼可见，就不必: x0 T( J& S. g* U3 x& C8 y# [
3.挑取的时候是用显微镜，显微镜先用酒精擦拭，放进工作台后再紫外灭菌，假如需要长时间操作的话，显微镜最好别往外拿
* }  w. w- v8 G4.准备好96孔板，其中放入适量（参考50ul）胰酶或其他酶准备消化用。准备24孔板，是消化后用来培养细胞的。
0 h8 B! U0 @" v7 T4 L& N5.用20ul的枪从细胞培养板中进行挑取，放入96孔板。消化一定时间后（参考5miin)，转入24孔板。" q0 j2 j' G1 G

暮色英雄

genedu 发表于 2011-11-16 13:42
5 j7 Q+ v1 B8 f2 i& b我的建议：根据我个人经验来讲- `% \0 K* u" C% P# I; @8 r
1.如果有很多死细胞的话，可以挑取之前先换一下液
, _1 }4 |4 X1 c& X: v: V7 s6 _2.如果干细胞球比较小的 ...

# Q0 S, w% m1 U8 O
干细胞球在显微镜下面看着都比较小，肉眼能看清楚吗？0 t) k( h2 @% ^% s3 L3 k' Z
另外为什么要用96孔板呢，挑出来的干细胞不能直接放到6孔板培养吗？而且我没有加血清的，还有必要用胰酶来消化吗？

genedu

回复 暮色英雄 的帖子( y0 k6 m( i, D) B& n3 i/ k$ P% l
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我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的，然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞球的话，时间比较长之后，他会长到肉眼可见。" ~. @" I- [7 |$ S
一般来说，消化之后细胞变得比较散，这样更加利于他的传代培养，还有消化的时候，并不是一定得用胰酶，胰酶只是最普通的消化酶，比如在大鼠的ES上，用胰酶效果就不是很好。

暮色英雄

genedu 发表于 2011-11-16 14:06
6 _5 Y) {% v: U0 ~回复 暮色英雄 的帖子5 m& }8 e! l9 Q6 E$ T; t; _  _/ \4 H

+ F4 w- L& Y: a7 g我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的，然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞 ...

' h0 H8 G7 j: P8 N1 R5 p5 J
嗯，还有一个问题，单独将干细胞球挑出来养是放在越小的孔里面养越好吗，比如用96孔板？

genedu

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$ T; l/ _3 f. i3 `, N" G一般96孔板是用来消化的，细胞量比较少的时候24孔板就行，真正培养细胞的话96孔板忒小

小木梅

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: C1 Z0 }3 N" H5 ]6 S& {- Q, h# q8 Y* y& o0 N( g, ]* p
我想请问一下  是不是一个96孔只挑一个球进去消化？在96孔里消化后直接移到24孔板里培养吗？这中间需不需要除去消化酶这一步骤？如何除去消化酶（50ul很少无法离心吧）？

genedu

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96孔板是只消化一个球，消化后直接移到24孔板，如果24孔板里面有血清就不需要去消化酶，如果没有的话，就先加2倍（100ul)中和，然后再放入24孔板

小木梅

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7 C% V$ _, f- c: [* {- K" m! t
) {  j2 \3 w. Q0 m7 P; ]谢谢，我用的是无血清培养基，中和就可以了是吧？24孔板一般加多少培养液呢？种下去后多久换液？一般挑细胞球是原代培养或者细胞系第一次成球的时候才做吗？另外请教一下，挑出来的细胞球有没有必要做标记，比如球一号，球二号……以及其各球后代要不要区分开来？

genedu

回复 小木梅 的帖子. W0 }% Q% h# L; R4 }

' e0 S! w( V: X无血清的就先在96孔板中和先，24孔板加1ml，第一次最好是24h换液，因为是有血清的；第一次成球就可以做，如果效果好的话；挑出来的球看你要干什么了；一般是看24孔板中那个球长得好，确定自己要用它来做下游实验的，才标记