请教MII期卵子染色体扩展

yahyo

有哪位大侠做过MII期卵子的染色体扩展吗？我用的是1%的柠檬酸钠通透，接着置于玻片上，逐滴加上10微升的固定液（甲醇：乙酸=3:1），结果卵子经常找不到，不能达到扩展一个卵子染色体的目的。而且几个卵子一起固定时，有些卵子染色体没散开，有些却冲的很散，这是为什么？希望各位能够帮帮我！我的最终目的是能够将一个卵子的染色体有效地扩展在玻片上，不要找不到卵子，谢谢！

yahyo

论坛里没有没高人指教一下啊？ 急！！

细胞海洋

回复 yahyo 的帖子0 H/ {8 ]  a' Z) X8 K

' `, ~! X- k1 S8 T  r周末人少 再耐心等等吧

xiaomingxu

楼主的问题真的是一个很棘手的问题，我们也尝试过做MII期卵母细胞核型，但效果也是不理想。
; I$ k4 o; ?8 ?- \# k! |+ D但可以就一些细节问题进行切磋：我们尝试的方法是，先AT去透明带，PBS清洗，然后，醋酸钠+BSA低渗（可以尝试KCL低渗），TW-20/HCL固定（楼主用甲醇：乙酸=3:1固定确实很剧烈，会发生卵母细胞找不到的情况，所以要尽量控制加的固定剂的量），后面常规操作，遇到的情况与你基本相同，有时可以见到完整的染色体，但有时染色体散的很开，也遇到染色体凝集在一起的情况。改进中......

yahyo

回复 xiaomingxu 的帖子4 j$ a1 |5 G7 H# L' u6 ?) L# O! S

% T( s" W( ~1 T: u- V: _% c谢谢你的回答！我试试缓和一点的固定方法，请问你有统计固定一个卵子的成功率有多少吗？

yahyo

论坛里面有做PGD（胚胎移植前基因诊断）的吗？个人觉得临床上的卵裂球原位杂交技术可以参考一下！

xiaomingxu

回复 yahyo 的帖子0 I9 j: B8 ]) M5 w" @4 C

: @/ p' L1 R' E6 ?0 |- [* g- o# A不知道你所说的成功率是指什么，如果只是看到核，那基本没什么问题的，如果要得到很好的分散染色体，那就比较低，大部分是分散度不好。

hcluo

' K+ N1 z* w% T2 K6 j" [9 j: c6 X8 T/ x$ \2 B
我也最近在做成熟卵母细胞的染色体核型，我得到和楼主差不多的结果，发现加入甲醇和冰乙酸固定液以后，确实对细胞的影响很大很剧烈。我用的低渗液是68nm的KCL, 用了三步固定液，第一步是固定液甲醇：冰乙酸：水=5:1:2，第二步固定液，甲醇：冰乙酸=3:1，第三步固定液是甲醇：冰乙酸：水=3:3:1，最后在载玻片上看到一些没有破裂的卵母细胞，还有很多不见了。所以也来求各位指导。你们也用超排来做成熟卵母细胞染色体分析吗？另外，烤片有必要吗？低渗液浓度是不是太低了啊？

hcluo

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6 ]! H0 `* X& e! s; @* I+ `* u  |! Q9 q/ O  a6 V% F% `, a- n
请问你用的低渗浓度是多少的啊？时间多少？固定液的浓度是怎么样的啊？具体需要多长时间啊？你是载玻片上固定吗？需要滴片吗？你用的AT是透明质酸酶吗，浓度多大啊，处理到什么程度？

yahyo

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8 o: W3 A" J: u, W/ z# h
# J+ {& Y; Z9 m- ?# z5 ]- u- W) E: i我说的成功率是看到核的成功率（即10次固定卵子染色体，每次一个卵，有几次可以看到染色体）。因为只有1个卵子，固定过程中容易被冲走而丢失，很容易找不到核，你是怎么标记固定卵子的大概位置呢？能讲下细节吗？谢谢！