请帮忙分析下RNA电泳结果

huangcong1988

RNA跑胶最好还是用变性胶，但是如果不用变性胶的话，胶中加点氢氧化钠也会使得图片好看点，胶的浓度对于跑胶结果，个人觉得没太大影响，胶浓点就少跑会，稀点就跑时间长点，跑胶这么短的时间不会说就使得RNA降解的，RNA降解主要还是在提取过程

jiojoo

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7 w0 O9 g7 u& C- Y" C" m) G+ y/ D9 @  Z8 G) v/ s4 G
我在做RT-PCR之前都会用DNaseI消化DNA的，这样DNA应该可以去除干净了吧？
& P5 u, @' N3 t8 [# P, n/ ?另外，我的目的是检测mRNA的表达水平，用Radom引物有没有问题？因为照原理来说，Oligo dT引物应该更好。
; N8 j7 L4 v. Z/ N2 `- f+ D上面那块胶中的样品，我做PCR得出的结果还是非常稳定的降解严重和不严重的结果都差不多。

jiojoo

回复 huangcong1988 的帖子# O. |) M$ Y0 {% _$ \4 X! l
7 S5 }& J" L( v) \5 R1 [
感谢回复- W- t3 r; |8 i6 s
我用的是Omega的RNA提取试剂，类似Trizol的试剂。这些是分次裂解于裂解液中，冻于-20度几天后再一次性提取的。
! H1 F% }0 g. |/ i还有些问题请教
$ T  v: B; B% S! `基因组的话，为什么是很单一的一条带呢？不是应该是一条弥散的带吗？
( Q$ }% Y" w( {6 S! e' J& D6 sFermentas的DNaseI消化DNA后样品的DNA污染应该可以消除了吧？& }" ^& w+ k$ Y8 i0 B
反转录后还需要用RNaseH去除RNA吗？

jiojoo

回复 星移龙一 的帖子4 f) D8 ?0 p- x7 i" h6 {3 Z

2 C) N0 B: }0 M; d5 P* l" I凝胶的问题会不会出现这种情况？5 ^8 J* R, z& |4 \
我们这里是刚开始做生物方面的实验，之前我一个同学配胶时用的水而不是TAE
, N3 t2 f& b4 T6 x6 G  A1 O4 w结果就是一条弥散的带，像降解了一样
+ R; T% X$ B  P% }然后他又用TAE来配，又跑了一次，结果RNA完整性其实是很好的

jiojoo

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0 U4 Y# [( x% [; O! D; F
, K- O9 o/ M/ N0 g% x感谢回复
+ s% l$ ~: A/ M+ rNaOH怎么加？需要加多少？NaOH的效果是不是也是使RNA变性？还请指教9 V& E6 Z8 M. I7 ]/ P( x
另外，胶浓的话应该是多跑一会儿吧？

xfyangsibs

降解严重，DNA污染同样严重。降解，，，，防降解的法子都用上，DNA除一下就行了

星移龙一

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/ R3 X1 {8 _( j. M: l+ t% W3 e& ^* n& ~3 s6 r
会啊，如果你用的水不太好，很容易在电泳过程中导致RNA的降解。

zhaoyan1983

我感觉如果只是实时定量PCR的话 应该是可以用的，但最好有内参 另外点样太多 有可能在你最后一个孔点样之前 前边几个就有部分降解了也说不定 RNA太小 最开始点样之后最好大电压跑一下 让RNA全部进到胶里边 所以感觉不一定是你提的不好 可能是跑的过程中降解了

cneagle66

jiojoo 发表于 2011-12-5 17:14
' u+ X( ?5 e3 O$ X! `回复 cneagle66 的帖子4 A8 B( f* Q" b1 T, H9 A7 h
7 T0 e. T% J9 B
我在做RT-PCR之前都会用DNaseI消化DNA的，这样DNA应该可以去除干净了吧？

8 S) T8 H7 c" _. C) l& `* c+ }! [, aDNase消化是很常用的办法，应该是很好的去除DNA污染的办法，严格的实验都要求将DNA去除。& r  `- o+ C1 s: X; Q9 j1 H
对于哺乳动物RT反应，用Oligo dT或者随机引物都可以。我前面说的引物设计问题，是指在PCR那一步，普通的RT-PCR可以通过设计横跨两个以上的外显子，来避免DNA污染所造成的扩增，因为DNA扩增出来的片段很大，或者因为内含子很长，从DNA扩增效率很低或不能扩增。但是对于荧光定量的RT-PCR，我不知道是不是也可以这样。至少我用sybr green的时候我是这样设计的，因为它不用探针，而且PCR产物较长，在一个大的范围内比较好挑选PCR引物对。但是对于用荧光探针的定量PCR，我没有经验。

huangcong1988

回复 jiojoo 的帖子6 k# A* J: ]' P7 H! b5 W. z# |
% U. u+ w* W2 g% q; x' y5 m
冻在负20数天？个人觉得可能冻在负80更好