请帮忙分析下RNA电泳结果

huangcong1988

回复 jiojoo 的帖子2 r5 E1 b* v; I3 d5 z' X
/ p5 ~0 K% w0 o2 G, L0 Z
我最近也遇到同样的问题，正在尝试解决的方案，就是用Fermentas 逆转录试剂盒里面的DNase 除掉 提的RNA里面的质粒

huangcong1988

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恩，对，胶浓点就多跑会，胶稀点就少跑会，氢氧化钠其实加多少没有硬性规定，我一般就跟加EB一样，加一滴，浓度其实低点无所谓

huangcong1988

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8 J1 a" l5 l) R$ ]" c
* d: Q" }: h3 X" `3 `# p4 z% L7 _没有，你提组织或者cell 总DNA的话，跑胶检测，你看到的是弥散的带？

cneagle66

加了TRizol的裂解液，按照说明书要求，是要放进-80度冰箱保存的，它的目的是要长期存放，比如一个月。不过，我曾经因为操作失误，放进-20度冰箱中一周，后来又提取RNA，效果没有什么不同。所以短时间-20度存放，应该还可以。

ielisa

RNA的完整性对实时定量的结果影响很大的，你的RNA降解很严重，应该是在操作过程中发生的降解，你是试剂盒抽提的，要么就是你一次抽提的样本多，时间间隔过长造成了降解，要么就是你进行试验时用的枪头啊，试剂啊含有RNA酶，建议试验开始前一定要做好准备工作。跑胶的浓度1%就可以了，跑胶的时间也不长，这个过程的降解微乎其微，不用变性电泳了。

cronos0910

这样的RNA sample还是可以用来跑real time PCR，做之前建议加DNase，因为你的TRIzol跟choloroform那步没做好，有明显的DNA污染，另外如果你想要准确点的real time PCR的结果，可以在目标基因的5'跟3'都设primer，做double check，如果还有问题，欢迎提出来一起讨论

linzi214

1.5%琼脂糖凝胶电泳10~15min就好，每个孔上样3~5ul RNA量，不要电泳太久。一般OD值测出来结果比较好的话，我们实验室只在第一次跑电泳鉴定抽提效果，后来直接做QRT，效果一样好，不过最好每次都电泳看一下

linzi214

/ m1 [* C& k9 S; W0 F. V

) j% g. M7 b8 Y$ r也可以将RNA和DNA电泳系统分开来用。RNA最好抽提定量后就先逆转录一批cDNA，然后保存在-80oC，这样不容易降解，逆转录为cDNA的样本更易保存。

jiojoo

回复 cronos0910 的帖子$ c" S7 K4 r' l; @; s) Q0 A: \4 i
3 U2 j2 }6 y: W4 a; e' p
感谢回复
1 T! W1 R$ _( ]0 g, ]6 P: Z8 GTrizol和Choloroform这步有什么问题会导致DNA污染呢？
3 [3 ?5 U0 M2 yTrizol裂解时间不够？Choloroform加的过量或过少？
- \6 n8 o+ u1 [: l  H还请指教
, E6 V& _6 r5 J谢谢

linzi214

加入Trizol吹打混匀后室温放置5min，加入氯仿颠倒混匀至分层液体变为均匀的小的粉色油状颗粒，总之一句话充分混匀，然后静置10min至分层，离心。离心后转移上层清澈液体即RNA至一干净EP管中，注意不要吸到白色的中间层。一帮情况下这样做是OK的。你再试一下，宁缺毋滥，再保证RNA量的情况下，还要主要RNA的纯度。