求助 ips核型鉴定

bb6120

最近在做ips细胞的核型鉴定。但是结果不是很好，求有经验的大哥指点一下！！
+ s2 ^) M& ?5 s# \实验步骤：; L/ y& O' Q  [6 m5 c
1、0.1μg/ml的秋水仙素处理一个钟。4 d' k5 L5 R7 C/ V. k2 W# P) z
2、0.075mol/L的KCl低渗20min。. G/ X7 M( n, f: J( I; L
3、1ml 固定液（固定液：甲醇：冰醋酸=3:1。）37℃水浴预固定3min。$ M/ J# P* T# F+ u" C
4、8ml 固定液2h。
( u! E4 o  B3 I2 y7 t$ e5、加入6ml 固定液进行第二次固定，10min。9 d0 i* x0 {* v' L
6、在-20℃内取出载玻片，摆于滴片架上，玻片约成10°倾斜，每片滴加悬液1滴。3 ~6 ~" ~7 q. {, B
/ I3 \+ |" u, q/ \' E
目前遇到的问题有：核型分离的不是很开！有的时候找不到核型！！1 o# ]+ J8 }1 n. N

, j6 a( L- n2 F% k; L! T求有经验的大哥指点！！！离心：1200rpm，离心10min。

genedu

首先您得确定是什么类型的细胞，细胞不同，条件也就跟着不同
% B, `7 o3 {2 ?

bb6120

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% [) B) {6 c' ?1 c) n9 M* A9 }& Q' O! s6 M0 f$ ^
诱导性多能干细胞（iPS）

genedu

回复 bb6120 的帖子4 W& w- O" f2 o/ F- j# @& F/ c

' W' r" l1 U5 M# H不好意思前两天出差，现在回复，在您的基础之上修改，只是按照自己的方法，我的做的还算不错，自我感觉
( k- J; E6 Z& m/ ~( p( z1、0.1μg/ml的秋水仙素处理两个钟。
0 H1 @$ \# S+ n8 y2、0.075mol/L的KCl低渗20min。后加几滴（500ul)固定液，轻轻摇匀，离心2 C# q2 A7 d' K+ i. T
3、去上清，1ml 固定液（固定液：甲醇：冰醋酸=3:1。）重悬，常温操作即可。
9 ?' I4 h3 B, a% K0 R' X- b4、8ml 固定液轻轻摇匀离心。注意我没有放置一段那么长的时间，感觉没必要
$ P: Z2 o  _9 g0 H5、加入6ml 固定液进行第二次固定。离心后，用1ml固定液重悬8 B& q5 x3 p, N0 Y
6、在-20℃内取出载玻片，摆于滴片架上，玻片约成45°倾斜，每片滴加悬液3滴，滴数根据细胞量而定，一般大概10的7次方三滴即可，高度大概1m。9 v: \( L# Y' b7 R- J; S+ B- z7 }
7.1：10配染料，凉干后，10min染色后用水冲背面，晾干即可，假如不G带的话+ F6 m3 h: w$ I4 y; L: Y. w
求有经验的大哥指点！！！
6 Q6 b- M: r- C' K" o. d" L! T离心：1200rpm，离心10min。

huangcong1988

回复 genedu 的帖子# F# |4 k3 J: T, y3 s2 [8 p

/ n. s  J; K1 B6 P2 [染色后，用水冲背面干嘛呢？

genedu

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/ U) d. }% W$ C" X( ^) T" x4 W3 d! G6 |3 n) U
就是染色后，需要将染料冲去，如果是正面的话，很有可能将核型冲走，但是如果是背面的话，不仅能将剩余的染料冲洗干净，而且不会冲走核型，完全是个人经验，建议您一使

huangcong1988

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5 C# t8 ~* K9 o* e0 [/ R, A4 v0 h* O9 W7 D, E. U6 l
但是冲背面怎么能把染液洗去呢？染液在正面啊

genedu

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7 @  D" Z6 ~0 d; g# \* ^
; s" O7 V: H1 T9 X嘿嘿，您先试试看，此言不虚

huangcong1988

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- S: q0 F% B, ?8 U
( i( K! ]" c( a$ J我还是用水洗的正面，就是很轻轻的洗，因为洗背面染液根本没有反应。。。

lcxlorna

注意事项：
1 D; X7 M$ f5 C* b! d0 {1、秋水仙素处时间延长到4h。
% Q! y: n1 z7 g! }. S2、0.075mol/L的KCl，37度预热，低渗20min, h* W3 F' W0 ^( \7 ^! q- F# _
3、干净的载玻片在-20℃要冷冻，滴前取出，取出后马上滴，最好拿高点儿滴，越高越好，这样细胞分散的好，且能摔开，高度20cm
1 C, e4 \( d' |& _# n) v4、燃料现用现配，
& [% ]" G0 C7 s' |试试看