求助 ips核型鉴定

bb6120

最近在做ips细胞的核型鉴定。但是结果不是很好，求有经验的大哥指点一下！！9 e: |- [  P) J$ l& \
实验步骤：
, D6 b* {5 F' i# W9 y" ~* v2 Q1、0.1μg/ml的秋水仙素处理一个钟。, s# z$ }- p* h# {, P
2、0.075mol/L的KCl低渗20min。8 X! z: Q2 T+ q" s5 G3 i/ V
3、1ml 固定液（固定液：甲醇：冰醋酸=3:1。）37℃水浴预固定3min。$ U* R2 D  D6 s+ v0 y
4、8ml 固定液2h。3 }1 z1 u( M9 Q$ J
5、加入6ml 固定液进行第二次固定，10min。
% V/ B8 D0 X) ^9 G! H  R& E$ n6、在-20℃内取出载玻片，摆于滴片架上，玻片约成10°倾斜，每片滴加悬液1滴。
" ~" y0 F8 l* M2 |* W/ P, R7 K& N) [$ q/ P( a# z
目前遇到的问题有：核型分离的不是很开！有的时候找不到核型！！
5 p% H/ N0 m9 F# v5 L
* ?* b5 Y# H4 V; Q5 F求有经验的大哥指点！！！离心：1200rpm，离心10min。

genedu

首先您得确定是什么类型的细胞，细胞不同，条件也就跟着不同& a. G, X( n: s( c2 A8 c) \2 Y# @

bb6120

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' |) G3 n2 |& v2 `& ]
, n$ P) I' i6 X诱导性多能干细胞（iPS）

genedu

回复 bb6120 的帖子3 v) o9 k* K5 ~8 V0 l2 m& M9 q
6 N5 |$ [4 o8 e/ K
不好意思前两天出差，现在回复，在您的基础之上修改，只是按照自己的方法，我的做的还算不错，自我感觉" ^$ R" p3 I* {" C5 |& ?/ t4 N8 Q& a4 x
1、0.1μg/ml的秋水仙素处理两个钟。
3 D0 _5 i6 u% i- s2、0.075mol/L的KCl低渗20min。后加几滴（500ul)固定液，轻轻摇匀，离心4 R7 j" p! _" B" I0 m+ }
3、去上清，1ml 固定液（固定液：甲醇：冰醋酸=3:1。）重悬，常温操作即可。% q: ]  ^, m2 U, S. o9 k
4、8ml 固定液轻轻摇匀离心。注意我没有放置一段那么长的时间，感觉没必要
, V& a# n) [( R  }5、加入6ml 固定液进行第二次固定。离心后，用1ml固定液重悬  z8 R9 E& z4 }/ ]( ~6 H8 O" H8 S
6、在-20℃内取出载玻片，摆于滴片架上，玻片约成45°倾斜，每片滴加悬液3滴，滴数根据细胞量而定，一般大概10的7次方三滴即可，高度大概1m。$ b: V7 Z1 a& e0 W, ^3 z: b, q0 {
7.1：10配染料，凉干后，10min染色后用水冲背面，晾干即可，假如不G带的话
. O5 ^3 ]) P6 P求有经验的大哥指点！！！- O# h0 T2 j0 p) u% M
离心：1200rpm，离心10min。

huangcong1988

回复 genedu 的帖子2 b6 d6 P# t" h

# I! x$ W, D, y7 z染色后，用水冲背面干嘛呢？

genedu

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" ?7 E2 w' B5 M0 o" Q0 ^' b: b! b  a4 |# b" t( h! Q
就是染色后，需要将染料冲去，如果是正面的话，很有可能将核型冲走，但是如果是背面的话，不仅能将剩余的染料冲洗干净，而且不会冲走核型，完全是个人经验，建议您一使

huangcong1988

回复 genedu 的帖子0 e0 x8 _' F  r+ o- ~% S

! S4 ~8 [4 _" r  I6 T5 G# ?- O& p* v但是冲背面怎么能把染液洗去呢？染液在正面啊

genedu

回复 huangcong1988 的帖子, j* G4 ~8 g; \0 R) k$ \
# b. V" C. l. e% h
嘿嘿，您先试试看，此言不虚

huangcong1988

回复 genedu 的帖子" E9 n% U! L# \
. H6 ^1 L4 ]$ p+ w6 W. T
我还是用水洗的正面，就是很轻轻的洗，因为洗背面染液根本没有反应。。。

lcxlorna

注意事项：: r* W+ r8 c- e# c5 ^7 c
1、秋水仙素处时间延长到4h。
; ~6 p* _% |) e1 q2、0.075mol/L的KCl，37度预热，低渗20min# x. ^" K) l/ ]0 C
3、干净的载玻片在-20℃要冷冻，滴前取出，取出后马上滴，最好拿高点儿滴，越高越好，这样细胞分散的好，且能摔开，高度20cm2 G- L1 c6 b, P; q
4、燃料现用现配，
. ~. k9 z( P1 `/ x7 d  J试试看