siRNA表达效率检测

xuyq706

构建了含前体shRNA序列的真核表达载体，转入真核细胞后如何检测siRNA是否表达？可否用miRNA的检测方法，stem-loop的方法？内参可以用U6吗？

moluxingke

你所用的表达载体上可否插入一些标记基因如GFP，通过荧光检测一下试试，个人认为其实最好的还是从靶蛋白水平上检测吧，毕竟是要看功能的，个人建议，仅供参考，呵呵

mansnoopy

加一些标签可能比较好，如EGFP等

hormone008

如果有钱的话，直接抽RNA，用taqman探针，检测你的靶标的表达量就可以了！  j9 C% \6 t( B: b& T: f0 Q

Yedan

一般没人测shRNA/siRNA的表达的，都是测KD的基因的，你有带GFP的转染or感染 control就行了。至于miRNA可以测的，也是应该测的。

echowdk

回复 moluxingke 的帖子
( V) y+ `+ }6 q& T
" ~+ G& J# Z' x1 |- W5 g- x其实我一直怀疑，荧光标签等的表达量变化是否可以直接代表目的蛋白的表达量变化。。。。

moluxingke

回复 echowdk 的帖子2 {: ~7 i4 j0 \: S0 F
: ?7 c* i* k8 d0 @) I9 C
呵呵，这个不好说，荧光标签的表达只是说明你这个载体的转染效率，也能说明siRNA表达，但是靶蛋白表达水平还和你设计的siRNA的效率有关的。

echowdk

回复 moluxingke 的帖子0 y7 v8 J" }  w6 m3 v
0 ?( ^, N2 i! C% ~5 S0 z
恩。一针见血啊。

kongpzh

表达效率，一般没人这么说的。
; k/ O+ `9 ~7 O8 U$ b, F8 d" c一般要看转染效率，就是通过带的荧光标签来看。" R. P  o- M/ e3 S3 l
要看干扰效率，就是通过RT-PCR或者蛋白western来检测。当然转染效率如果不高，检测出来的瞬时的干扰效率也不准确，可能就需要筛选单克隆来检测了。

trl137

一般做RNA干扰载体都在其中加的标记基因，如GFP，或者融合蛋白；转然后可通过荧光检测效率，也可以从转录水平检测