最近在养人的真皮成纤维细胞,但是整个过程未见单个细胞,请各位战友帮我分析一下原因 - 皮肤干细胞专区干细胞之家



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ujj_hong

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楼主

发表于 2012-3-13 15:03 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

我最近在养人的真皮成纤维细胞,但是整个过程未见单个细胞,请各位战友帮我分析一下原因.我的具体方法是:) J5 P$ Z1 q& Q1 X* U
(1)将皮肤置于75%的酒精中消毒1min;8 N! {# F, y4 x8 q/ ]: W* t) |" p
(2)将皮肤置于双抗中浸泡30min;
(3)配置浓度为0.2%的DispaseⅡ酶,将皮肤剪成2×5mm的条状,放入酶中,4度作用17小时;
(4)将真皮和表皮用镊子分离;
(5)将真皮组织用眼科剪刀剪碎,平铺在培养瓶中,倒置,加入3mL培养基(DMEM培养基+15%胎牛血清),3小时后,轻轻翻转培养瓶培养;培养了5天后仍未见有细胞爬出. 显微镜下观察只是看到很多线团,像头发一样粗细,没有单个的细胞./ X; ]' P3 l, V, l
(6)另外我还做了一组对照,将真皮组织用胶原酶消化,动态观察消化的整个过程,但奇怪的是,整个过程中没有观察到单个细胞1 l& L" B) A& m& i2 ~( ^
请各位战友帮我分析一下这是什么情况,为什么整个过程都没有单个细胞出现呢?谢谢!

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沙发

发表于 2012-3-13 15:09 |只看该作者

另外想请问一下,标本拿回来后因为不能及时进行实验,所以将标本直接放到液氮中去了,不知道这样是否也会影响细胞的活力?

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chongziqiong

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藤椅

发表于 2012-3-14 10:35 |只看该作者

取来的新鲜标本最好马上就做，年轻的可以在培养基里4°放置一天，年龄偏大的最好当天就做。我一般取来标本后碘酒、酒精、加双抗的PBS依次浸泡后，要用手术刀把多余的脂肪层刮掉（越干净越好），4°消化过夜，后分离表皮层和真皮层。然后把真皮切成2mm左右的小方块，然后真皮层朝下，贴到培养皿里。加入培养液，培养就好了，一般3-4d就会有细胞爬出啦。